结核感染T细胞斑点试验联合结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术在痰涂阴性肺结核诊断中的应用价值

李伦，张智辉

(平顶山市第一人民医院 a.医学检验科；b.呼吸内科，河南 平顶山 467000)

有研究显示，全球每年约有600万新增结核病患者，我国结核病形势亦十分严峻[1-2]。患者早期多表现为消瘦、乏力、低热，目前临床以细菌学检查为“金标准”，但对于部分少痰或者无痰者，会出现漏诊。结核感染T细胞斑点试验(T cell spot test in tuberculosis infection，T-SPOT.TB)是通过刺激外周血单核细胞中特异性活化T淋巴细胞分泌γ干扰素，并检测效应T细胞数量进行结核杆菌诊断。T-SPOT.TB受非结核分枝杆菌感染、卡介苗接种影响较小，但在活动性结核病患者中的诊断价值有限。结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术(simultaneous amplification and testing method for mycobacterium tuberculosis，sAT-TB)是将结核分枝杆菌特异性16S rRNA作为靶目标，通过恒温RNA扩增技术扩增靶标片段，荧光标记的探针与靶标片段的扩增产物杂交后释放荧光信号，快速、准确进行诊断，根据判读结果判断待检样本中是否含有结核分枝杆菌。临床研究发现，该技术在痰涂片阳性标本的肺结核患者中诊断灵敏度较高，但仍会出现误诊[3-4]。本研究选取806例痰涂阴性肺结核患者为研究对象，比较T-SPOT.TB、sAT-TB单独检测与联合检测在诊断痰涂阴性肺结核中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年6月至2019年12月平顶山市第一人民医院收治的806例痰涂阴性肺结核患者为观察组，男451例，女355例；年龄26～59岁，平均(42.63±7.34)岁；体质量指数(body mass index, BMI)17～26 kg·m-2，平均(21.79±2.03)kg·m-2。选取同期疑似肺结核患者100例为对照组，男56例，女44例；年龄25～58岁，平均(44.01±6.98)岁；BMI 17～27 kg·m-2，平均(22.01±1.98)kg·m-2。本研究经平顶山市第一人民医院医学伦理委员会审核通过。两组患者性别、年龄、BMI比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 选取标准(1)纳入标准：①观察组经实验室细菌学、组织学、影像学、临床表现等检查确诊为痰涂阴性肺结核；②对照组存在肺部异常阴影，疑似肺结核，但经实验室细菌学、组织学、影像学、临床表现等检查排除肺结核；③涂片抗酸染色连续3次呈阴性。(2)排除标准：①严重病毒感染史；②肝、肾功能障碍；③临床资料不完整。

1.3 检测方法两组均接受T-SPOT.TB、sAT-TB检测。(1)T-SPOT.TB检测：取晨起7:30至8:30外周静脉血5 mL，对外周血单个核细胞进行分离处理，采用上海仁度生物技术有限公司提供的相关试剂盒进行检测，加入结核特异性抗原早期分泌靶向抗原和培养滤过蛋白作为刺激原，统计斑点数，定量分析淋巴细胞数量。阳性标准：①空白对照孔内斑点数目小于6个，但其他任何试验孔内斑点数目减去空白对照孔内斑点数目后仍≥6个；②空白对照孔斑点数目>6个，但其他任何试验孔内斑点数目是空白孔斑点数目的2倍以上。(2)sAT-TB检测：采用结核分枝杆菌核酸检测RNA恒温扩增仪、试剂盒检测。阳性标准：①dt≤35为阳性；②35

1.4 观察指标(1)T-SPOT.TB、sAT-TB检测单独与联合诊断痰涂阴性肺结核的诊断结果。(2)T-SPOT.TB、sAT-TB检测单独与联合诊断的诊断效能。

1.5 统计学方法采用SPSS 22.0统计软件处理数据，计数资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 诊断结果T-SPOT.TB诊断真阳性733例，真阴性57例，漏诊73例，误诊43例；sAT-TB诊断真阳性540例，真阴性88例，漏诊266例，误诊12例；联合诊断真阳性799例，真阴性56例，漏诊7例，误诊44例。见表1。

表1 诊断结果(n)

2.2 诊断效能联合诊断痰涂阴性肺结核准确度、灵敏度、阴性预测值高于T-SPOT.TB、sAT-TB单独诊断，漏诊率低于T-SPOT.TB、sAT-TB单独诊断，差异有统计学意义(P<0.05)；联合诊断特异度、阳性预测值低于sAT-TB单独诊断，误诊率高于sAT-TB单独诊断，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 诊断效能比较[%(n)]

3 讨论

影像学为目前临床诊断痰涂阴性肺结核最常用的手段，但难以与其他肺部疾病区分，而涂片镜检法诊断灵敏度低。因而，寻找快速、准确的诊断方法已成为临床工作重点。

经抗原提呈细胞处理后的结核分枝杆菌可活化、增殖T淋巴细胞，变为致敏淋巴细胞，若再次接触结核分枝杆菌，会大量释放细胞因子，发挥抗炎作用。免疫应答的强度不仅与机体免疫状态相关，还与结核分枝杆菌数量密切相关[5-7]。T-SPOT.TB 试验检测特殊抗原刺激后产生IFN-γ T细胞数量，而IFN-γ与抗原数量、疾病活动状态有关，肺结核患者经抗结核治疗后，结核分枝杆菌的数量下降，细胞免疫应答强度随之下降，受到抗原活化后产生IFN-γ T细胞数量减少，故T-SPOT.TB试验会导致假阴性，误诊率较高，故需与其他诊断方案联合使用，以提高诊断价值[8-9]。

sAT-TB以RNA恒温扩增技术、实时荧光检测技术为基础，具有检测速率快、灵敏度高等优点。王静等[10]指出，sAT-TB可区分死菌和活菌，诊断痰涂阴性肺结核ROC曲线下面积达0.670，能避免假阳性、临床判断不准确等问题，在结核病筛查中具有重要价值。本研究发现sAT-TB诊断痰涂阴性肺结核，特异性高达88.00%，能有效降低误诊率。此外，RNA易降解，能有效避免污染问题。本研究结果显示，联合诊断痰涂阴性肺结核准确度、灵敏度、阴性预测值高于T-SPOT.TB、sAT-TB单独诊断，漏诊率低于T-SPOT.TB、sAT-TB单独诊断，提示T-SPOT.TB、sAT-TB联合能有效提高痰涂阴性肺结核准确度、灵敏度、阴性预测值，主要与二者的诊断原理不同有关，T-SPOT.TB具有较高灵敏度，而sAT-TB特异度较高，联合诊断能充分发挥二者优势，提高诊断价值，减少漏诊，但联合诊断特异度、阳性预测值低于sAT-TB单独诊断，必要时需实施细菌培养，以降低误诊风险。

综上所述，T-SPOT.TB、sAT-TB联合能有效提高痰涂阴性肺结核诊断的准确度、灵敏度、阴性预测值，降低漏诊率，但特异性较低，必要时需实施细菌培养，以降低误诊风险，可为临床诊断及制定治疗方案提供影像学依据。