分光光度法测定发酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量

韩秋珍，罗珮妍，凌育昕，罗小宝，周芳梅

（1.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州 511442；2.广东省食品质量监督检验站，广东广州 511442； 3.广东省食品工业公共实验室，广东广州 511442）

枸杞多糖作为一种天然植物多糖，具有重要的生物活性，具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗炎镇痛、抗疲劳、神经保护及生殖功能保护等作用[1-3]。枸杞多糖作为发酵型枸杞酒中的重要功能成分，对其含量进行检测很有必要。目前测定多糖的标准主要采用葡萄糖作为标准物质，苯酚-硫酸法进行样品前处理，分光光度法进行测定，但这些标准方法不适用于测定发酵型枸杞酒中的枸杞多糖含量[4-6]。由于选择葡萄糖作为标准物质时，需进行系数换算，本方法直接选用葡聚糖作为标准物质。本方法主要从苯酚用量、硫酸用量、检测波长3个方面进行实验比较，得到最佳的检测方法，为优选发酵型枸杞酒提供依据。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂

浓硫酸（比重1.84）；标准物质：葡聚糖（CAS号9004-54-0）；苯酚溶液（50 g/L）：称取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀释至100 mL，混匀；无水乙醇；80%（V/V）乙醇溶液：20 mL水中加入无水乙醇80 mL，混匀。

1.1.2 仪器与设备

分光光度计、离心机（3 000 r/min）、50 mL离心管等。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制

（1）储备液的配制。准确称取相对分子质量5×105已干燥恒重的葡聚糖标准品0.104 6 g，加水溶解，并定容至100 mL， 混匀，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有1.046 mg葡聚糖。

（2）标准曲线的绘制。吸取葡聚糖标准储备液10.00 mL， 置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，混匀，置冰箱中保存。此溶液1 mL含有葡聚糖0.104 6 mg葡聚糖。准确吸取此标准使用液0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、 0.80 mL和1.00 mL分别置于25 mL具塞试管中，各加水至2.0 mL，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入浓硫酸10.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后于485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度，以葡聚糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 样品溶液的制备及测定

（1）沉淀枸杞多糖。移取5.00 mL试样于50 mL离心管中，加入无水乙醇20 mL，混匀5 min后，以3 000 r/min离心5 min，弃去上清液。残渣用10 mL 80%（体积分数）乙醇溶液洗涤，离心后弃去上清液，反复操作4次。残渣用水溶解并定容至25.00 mL。

（2）样品的测定。准确吸取样品测定液2.00 mL置于25 mL具塞试管中，加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入浓硫酸10.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴中煮沸 2 min，冷却后于485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度，根据标准曲线查出吸取的待测液中葡聚糖的含量，计算样品中枸杞多糖含量，同时做样品空白 实验。

2 结果与分析

2.1 苯酚用量的选择

分别准确吸取5份葡聚糖标准溶液1.00 mL于5支25 mL 具塞试管中，再在具塞试管中分别加入0.6 mL、0.8 mL、 1.0 mL、1.2 mL和1.4 mL的苯酚溶液，各加水至3.0 mL，小心加入浓硫酸10.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后于485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度，选择较适合苯酚用量。随着苯酚用量增加吸光值相应增加，在1.0 mL时出现最大值，后随着苯酚继续增加吸光值有所下降。因此，最终选择苯酚用量为1.0 mL。

2.2 硫酸用量的选择

分别准确吸取5份葡聚糖标准溶液1.00 mL于5支25 mL 具塞试管中，各加入苯酚溶液1.0 mL，小心加入浓硫酸 6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL、12.0 mL和14.0 mL,摇匀后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后于485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定测定吸光度，选择较适合硫酸用量。随着硫酸用量增加吸光值相应增加，在10.0 mL时出现最大值，后随着硫酸继续增加吸光值有所下降。因此，最终选择硫酸用量为10.0 mL。

2.3 检测波长的选择

取空白对照和样品溶液，分别经苯酚-硫酸试剂显色后，用分光光度计在400～800 nm波长范围内作全波长扫描则定，两者均在485 nm处有最大吸收，故选择485 nm作为测定波长。

2.4 线性范围及检出限、定量限

标准使用液按1.2.2进行测定，以浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线、相关系数、检出限和定量限见表1。

表1 标准曲线、相关系数、检出限和定量限

2.5 方法的准确度和精密度

准确称取相对分子质量5×105已干燥恒重的葡聚糖标准品0.104 6 g，加水溶解并定容至100 mL，混匀，分别取浓度为1.046 mg/L的葡聚糖标准溶液0.25 mL、0.50 mL、 1.00 mL加入预先加入5.00 mL样液的50 mL的离心管中，其余按上述样品的制备及测定操作，根据标准曲线查出吸取的待测液中葡聚糖的质量。其中加标浓度为5.23 mg/100 mL、 10.46 mg/100 mL及20.92 mg/mL的测定用所试样测定液的体积为1.0 mL，使其浓度处于标准曲线范围内。进行3个浓度水平的试验，每个浓度水平需要独立检测6次。结果见表2。回收率范围为92%～106%，相对标准偏差范围为1.9%～3.5%。

表2 准确度和精密度

2.6 实际样品的测定

用本实验方法对7个发酵型枸杞酒样品进行测定分析，每个样品重复测定2次。检测结果见表3。

表3 发酵型枸杞酒样品检测结果

3 结论

本研究采用乙醇溶液除去单糖、低聚糖、甙类及生物碱等干扰性成分。用水溶解乙醇沉淀物中所含的多糖类成分。多糖类成分在硫酸作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法于485 nm波长处测定其多糖含量。

采用苯酚-硫酸比色法测定发酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的最佳显色条件为苯酚溶液（50 g/L）用量1.0 mL，硫酸用量10.0 mL，摇匀后放置5 min，置沸水浴中煮沸2 min，冷却后于485 nm处以试剂空白为参比，1 cm比色皿测定吸光度。通过加样回收率试验和精密度试验，回收率范围为92%～106%，相对标准偏差范围为1.9%～3.5%。表明采用此方法检测发酵型枸杞酒中枸杞多糖含量准确度高、精密度好、加样回收率高，本方法适合于发酵型枸杞酒中枸杞多糖含量的测定。