升陷汤标准煎液HPLC⁃ELSD 特征指纹图谱建立及3种成分测定

常丽静李明月韦花花陈 新

（长春中医药大学长白山道地药材药效物质重点研究室，吉林 长春130117）

升陷汤是《古代经典名方目录（第一批）》中第73 首方剂，源于《医学衷中参西录》，由君药黄芪、臣药柴胡及升麻、佐药知母、使药桔梗组成，主治胸中大气下陷，气短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘，或气息将停，危在顷刻。现代研究表明，该方对急性呼吸窘迫综合征患者疗效明显［1］，加味联合硫酸沙丁胺醇治疗慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用明显优于单用硫酸沙丁胺醇，可改善呼吸力学指标、血气分析指标，调节血清过氧化脂质水平［2］，不良反应少，是一种安全有效的治疗策略［3］，但目前缺乏其质量评价及监测方法，也尚无关于其物质基准的报道。

本实验采用HPLC⁃ELSD 法建立了升陷汤标准煎液的特征指纹图谱，并通过电导仪、PH 计对其质量进行实时监控，可弥补该方成分分析与质量控制的空缺，并为其他复方制剂物质基准的相关研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器 LXJ⁃ⅡB 低速大容量多管离心机（上海安亭科学仪器厂）；HWS12型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Centrifuge 5810R高速冷冻离心机（德国艾本德公司）；DDSJ⁃308A电导率仪（上海雷磁仪器厂）；实验室PH 计［梅特勒⁃托利多仪器（上海）有限公司］。

1.2 试剂与药物 黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 对照品（批号110781⁃201616、111839⁃201505、111851⁃201708，纯 度 96.9%、94.5%、96.9%，中国食品药品检定研究院）。乙腈为色谱纯（美国Fisher 公司）；水为蒸馏水。

1.3 药材 黄芪（产地甘肃、河北、内蒙古）、柴胡（产地山西、甘肃、陕西）、升麻（产地吉林）、桔梗（产地河北）、知母（产地河北）各15批，均购自吉林省安国药业集团有限公司、吉林省北药药材加工有限公司，经长春中医药大学药学院实验中心肖井雷教授鉴定为正品。升陷汤中上述5味饮片均为生用，将其切制成厚片，并予以编号。

2 方法

2.1 标准煎液制备 《医学衷中参西录》［4］记载，升陷汤原方为“生箭芪六钱，知母三钱，柴胡一钱五分、桔梗一钱五分、升麻一钱”，而在清代一两（37.3 g）为十钱，一钱为十分，则一钱为3.73 g，五分为1.865 g，即方中组方药材用量分别为黄芪22.4 g、知母11.2 g、柴胡5.6 g、桔梗5.6 g、升麻3.7 g。根据前期遵古研究升陷汤煎煮工艺，以桑柴火为煎煮用火，结合医家用药习惯“知母后下”“煮数沸”“次煎原不可废”确定煎煮方法，以煎出量“一大盅”确定加水量，通过HPLC⁃DAD 紫外指纹图谱进行电加热工艺拟合，具体方法为按处方剂量称取药味共48.5 g，先将黄芪、升麻、柴胡、桔梗饮片置于分体黑陶壶中，加10 倍量水浸泡30 min，200 ℃电陶炉加热至沸，沸后8 min 下知母饮片，继续煎煮7 min，滤过，药渣加8 倍量水，200 ℃电陶炉加热至沸，沸后继续煎煮10 min，滤过，煎液合并2 次，适当煎煮至500 mL，即得。信息见表1。

表1 15 批样品信息Tab.1 Information of fifteen batches of samples

2.2 色谱条件

2.2.1 特征指纹图谱 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）⁃水（B），梯度洗脱（0～20 min，90%～75%A；20～50 min，75%～70% A；50～70 min，70%～68% A；70～80 min，68% A；80～90 min，68%～90%A）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；进样量10 μL；蒸发器温度80 ℃；雾化器温度50 ℃；载气体积流量1 600 mL／min。

2.2.2 黄芪甲苷含量测定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃水（32∶68）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；进样量2、10 μL（对照品）及10 μL（供试品）；蒸发器温度50 ℃；雾化器温度50 ℃；载气体积流量1 400 mL／min.

2.2.3 知母皂苷BⅡ含量测定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈⁃水（25∶75）；体积流量1.0 mL／min；柱温25 ℃；进样量2、10 μL（对照品）及10 μL（供试品）；蒸发器温度50 ℃；雾化器温度50 ℃；载气体积流量1 400 mL／min.

2.2.4 桔梗皂苷D 含量测定 YMC⁃Pack ODS⁃A色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 pm）；流动相乙腈⁃水（25∶75）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；进样量：进样量2、10 μL（对照品）及10 μL（供试品）；蒸发器温度80 ℃；雾化器温度50 ℃；载气体积流量1 600 mL／min.

2.3 对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 对照品适量，80%甲醇制备成含0.484 8 mg／mL 黄芪甲苷的对照品溶液，30%丙酮制备成含0.498 0 mg／mL 知母皂苷BⅡ的对照品溶液，甲醇制备成含0.499 7 mg／mL 桔梗皂苷D的对照品溶液。

2.4 供试品溶液制备

2.4.1 特征指纹图谱 精密量取90 mL 标准煎液，加入95%乙醇至含醇量为70%，静置过夜，醇沉液离心30 min，上清液蒸干，10 mL 蒸馏水分次溶解完全，10 000 r／min 离心10 min，吸取上清液，置于分液漏斗中，10 mL 乙酸乙酯振摇提取1 次，分取水层，水饱和正丁醇充分振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇层，氨试液洗涤2 次，每次40 mL，弃去氨试液层，正丁醇液层于恒温水浴锅中蒸干，甲醇溶解定容至5 mL，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.2 特征指纹图谱阴性 按照全处方比例药味48.5 g，称取相应质量缺黄芪、缺柴胡、缺升麻、缺桔梗、缺知母的阴性处方，按“2.1”项下方法制备阴性标准煎液，再按“2.4.1”项下方法制备相应阴性供试品溶液。

2.4.3 黄芪甲苷含量测定 精密量取标准煎液50 mL，水饱和正丁醇充分振摇提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨试液洗涤2 次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.4 知母皂苷BⅡ含量测定 精密量取标准煎液20 mL，水浴浓缩至浸膏状，加2 g 硅藻土分散，10 mL 30% 丙酮超声（400 W、40 kHz）处 理10 min，滤过，取续滤液，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.4.5 桔梗皂苷D 含量测定 精密量取升陷汤标准煎液150 mL，水浴浓缩至浸膏状，加10 g 硅藻土分散，50 mL 50% 甲醇超声（400 W、40 kHz）处理10 min，离心30 min，取25 mL 上清液蒸干，加20 mL 水溶解，水饱和正丁醇振摇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，50 mL 氨试液洗涤，弃去氨液，正丁醇饱和水洗涤，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加适量甲醇溶解，转移至2 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

2.5 特征指纹图谱方法学考察

2.5.1 专属性试验 取“2.3”“2.4.1”“2.4.2”项下溶液适量，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分分离度理想，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC⁃ELSD 色谱图Fig.1 HPLC⁃ELSD chromatograms of various constituents

2.5.2 精密度试验 取“2.1”项下标准煎液（S1），按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，以4号峰（桔梗皂苷D）为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别小于0.15%、1.79%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取“2.1”项下标准煎液（S1），按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，于0、1.5、3.0、4.5、9、12、18、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以4号峰（桔梗皂苷D）为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别小于0.32%、2.77%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.4 重复性试验 取“2.1”项下标准煎液（S1），按“2.4.1”项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以4号峰（桔梗皂苷D）为参照，测得各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD分别小于0.18%、3.25%，表明该方法重复性良好。

2.6 HPLC⁃ELSD 特征指纹图谱建立 取“2.1”项下标准煎液15 批，按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，色谱图见图1，将其导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）”软件，采用自动匹配法生成共有模式对照图谱，以S1 为参照，发现6个共有峰，按保留时间先后依次编号1～6（图2）。经与对照品溶液对比，确定3号峰为知母皂苷BⅡ，4号峰为桔梗皂苷D，6号峰为黄芪甲苷，其中4号峰响应值较高，分离度较好，保留时间相对稳定，故选择其作为参照峰。

图2 15 批样品HPLC⁃ELSD 特征指纹图谱Fig.2 HPLC⁃ELSD characteristic fingerprints of fifteen batches of samples

保留时间窗口设定为0.5 min，采用多点校正后进行自动匹配，测得15 批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.911、0.962、0.983、0.960、0.963、0.976、0.956、0.942、0.940、0.940、0.950、0.982、0.964、0.966、0.935，表明各成分比较稳定，对照指纹图谱具有很好的代表性。

由图1 可知，2号、3号（知母皂苷BⅡ）、5号峰归属于知母，4号（桔梗皂苷D）峰归属于桔梗，6号峰归属于黄芪，以4号峰为参照，计算6个共有峰相对峰面积，见表2，并计算其相对保留时间，见表3。由此可知，各共有峰相对保留时间RSD 均小于0.49%，表明对照指纹图谱稳定可靠，可反映标准煎液中各药味化学特征。

表2 15 批样品共有峰相对峰面积Tab.2 Relative peak areas of common peaks of fifteen batches of samples

表3 15 批样品共有峰相对保留时间Tab.3 Relative retention time of common peaks of fifteen batches of samples

2.7 各成分含量测定

2.7.1 线性关系考察 吸取黄芪甲苷对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，知母皂苷BⅡ对照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，桔梗皂苷D 对照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，分别在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项色谱条件下进样测定。以各成分峰面积对数为纵坐标（Y），进样量对数为横坐标（X）进行回归，结果见表4，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.7.2 精密度试验 取升陷汤物质基准（S1），分别按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项色谱条件下各进样测定6 次，测得黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面积RSD分别为0.26%、0.42%、0.31%，表明仪器精密度良好。

2.7.3 重复性试验 取升陷汤物质基准（S1），分别按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”项下方法制备供试品溶液各6 份，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项色谱条件下进样测定，测得黄芪甲苷、知母皂苷B Ⅱ、桔梗皂苷D含量RSD分别为0.63%、1.16%、0.59%，表明该方法重复性良好。

2.7.4 稳定性试验 取升陷汤物质基准（S1），分别按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”项下方法制备供试品溶液，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项色谱条件下进样测定，测得黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面积RSD分别为0.85%、1.28%、0.74%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7.5 加样回收率试验 取升陷汤物质基准（S1），分别按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”项下方法制备供试品溶液，精密加入含黄芪甲苷0.484 8 mg／mL、知母皂苷BⅡ0.498 0 mg／mL、桔梗皂苷D 0.499 7 mg／mL的对照品溶液1、4、1 mL，计算回收率。结果，黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 平均加样回收率分别为95.64%、103.42%、97.42%，RSD分别为1.82%、3.34%、2.06%。

2.8 结果 取15 批升陷汤物质基准，分别按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表5，色谱图见图3。

图3 各成分HPLC 色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表5 各成分含量测定结果Tab.5 Results of content determination of various constituents

2.9 理化指标测定 取15 批标准煎液及缺相应药材的阴性煎液，采用电导仪及实验室pH 计趁热（50～70 ℃）测定总溶解固体（TDS）、盐度、电导率、pH值、电位，结果见表6，可知各批样品物质基准理化指标差异不大，较为一致。因此，可通过理化指标监测对升陷汤标准煎液的一致性进行判断，要求各数值应在表4 范围内波动，从而实现对该方物质基准制备过程的质量监控。

除加水量以全处方计外，按“2.1”项下方法制备缺相应药材的阴性煎液，测定理化指标，结果见表7。由此可知，当煎法错误时，TDS、盐度、电导率与表6 相比有明显差异，故测定理化指标可迅速对升陷汤物质基准质量进行判断，并为该方后期中间体、制剂制备及工业化大生产提供在线监测的质量研究思路，并且操作者可立即发现问题，从而减少煎错药、少煎药的风险。

表6 15 批样品理化指标测定结果Tab.6 Results of physical and chemical index determination of fifteen batches of samples

3 讨论

物质基准的指纹图谱信息是经典名方开发过程中主要成分迁移的重要表达［5］，主要特点是突出该品种与其他品种不同的特异性成分。研究表明，黄芪中黄芪甲苷可抑制哮喘发展和严重程度［6］、保护损伤心肌细胞［7］；对知母的考察主要集中在知母皂苷BⅡ及芒果苷、新芒果苷等成分，其中知母皂苷BⅡ具有一定促血管新生、修复受损血管的作用［8］，芒果苷可抑制缺氧复氧损伤所造成的心肌细胞活力下降及细胞凋亡［9］；桔梗中桔梗皂苷D具有明显的镇痛、抑制癌细胞作用［10⁃11］；柴胡中主要化学成分为皂苷类，以柴胡皂苷a、d 为代表；升麻主要含有环阿尔廷型三萜皂苷、酚酸类等成分，阿魏酸、异阿魏酸是其潜在活性物质［12⁃13］。另外，黄芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 无紫外吸收，需采用蒸发光检测器，而芒果苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、异阿魏酸需采用紫外检测器，并且检测波长集中在210、260 nm。

《医学衷中参西录》 中黄芪、知母同用的方剂共18 首，张锡纯将两者相互作用描述为“黄芪性稍热，故以知母之凉润者济之”，凸显出复方配伍的重要性，而对使药桔梗的作用描述为“药中之舟楫，能载诸药之力上达胸中，故用之为向导也”。依据君臣佐使配伍原则及指标成分检测条件，本实验首先建立以黄芪、知母、桔梗为主要代表的升陷汤标准煎液HPLC⁃ELSD 特征图谱。

电导率是用来描述物质中电荷流动难易程度的参数，而纯水无电导率，在升陷汤煎煮过程中皂苷、黄酮、多糖、无机盐等成分透过细胞壁向水中扩散，由此产生信号［14⁃15］。由于方中桔梗、升麻中含有较多的酚酸类物质，故其pH 呈弱酸性。TDS 是指1 L 水中能溶解的溶解性固体量，其数值越高，表明水中溶解物越多。本实验通过检测TDS、电导率、电位、pH值等理化指标可实现升陷汤物质基准的质量在线监控，并能为其他复方制剂质量及制药过程的一致性评价提供研究思路。