肉苁蓉总苷中4种雌激素样活性成分的药动学研究

胡 扬高佳雪綦 峥徐蓓蕾曲中原梁 伟宋 辉孙向明丁振铎 李文兰

（哈尔滨商业大学，黑龙江 哈尔滨150076）

肉苁蓉作为补益中药，可补肾虚、壮肾阳、益精血，在我国用药历史悠久，临床常用于治疗女子宫寒不孕、男子肾虚阳痿等症，同时具有保肝护肝、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤作用，有“沙漠人参”的美誉［1⁃2］。中药药代动力学是以遵循中医药理论为前提，对药物进入机体后的时量⁃时效关系及其动态变化规律，通过数学函数进行定量描述的一门学科［3］，随着中药现代化的不断推进、中医药理论的蓬勃发展，当前中药药代动力学的研究对象已逐渐由传统的单体成分转变为具有明显药效作用的活性成分群［4⁃5］，由于中药具有多成分、多靶点、整合调节的特点［6⁃7］，这种转变可使得相关研究更透彻，更具有科学意义。

近年来，课题组对肉苁蓉雌激素作用进行了大量研究，证实其有效部位为总苷［8］，并通过构建“固有成分⁃体内成分⁃雌激素活性”谱效研究模型，确定松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷等13种成分是相关药效物质基础［9］。为进一步揭示上述成分的体内过程，本实验采用超高效液相色谱⁃串联三重四级杆质谱（UPLC⁃MS／MS）对松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷进行药动学研究，以期将肉苁蓉深度开发为植物雌激素5 类新药奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 肉苁蓉总苷（质量分数为62.5%，以毛蕊花糖苷计），按照文献［10］报道的方法自制。绿原酸、红景天苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷、丁香苷对照品（纯度＞98%，批号分别为110753⁃201716、110818⁃201206、111530⁃201411、111670⁃201304、11574⁃200201）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇为色谱纯（德国默克公司，批号分别为20170410、20170311）；甲酸为色谱纯（河南科锐化工有限公司，批号20160509）；正丁醇为分析纯（批号20140210）、乙酸乙酯（批号20150308）为分析纯（天津福晨化学试剂有限公司）；水为纯净水［屈臣氏集团（香港）有限公司，批号20171205］。

1.2 仪器 ACQUITY UPLC 色谱仪、Xevo TQD 质谱仪（美国Waters 公司）；AR1140 电子分析天平（美国奥豪斯公司）；超声波清洗器、Neofuge 高速冷冻离心机（上海力申科学仪器有限公司）；GENIUS N118LA 氮气发生器（英国Peak 公司）。

1.3 动物 Wistar 雌性大鼠，体质量（210±20）g，购自哈尔滨医科大学实验动物学部，动物生产许可证号SCXK（黑）2013⁃001，自由饮水饮食，在室温（23±2）℃、相对湿度50%～60%下适应性饲养7 d。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷对照品适量，50% 乙腈稀释，即得（质量浓度为250 μg／mL）。

2.1.2 内标溶液 精密称取绿原酸对照品适量，50%乙腈稀释，即得（质量浓度为500 ng／mL）。

2.1.3 灌胃液 取肉苁蓉总苷适量，蒸馏水稀释至75 mg／mL（含松果菊苷1.346 mg／mL、丁香苷1.195 mg／mL、红景天苷0.631 mg／mL、毛蕊花糖苷1.487 mg／mL），即得。

2.2 分析条件

2.2.1 色谱 Waters BEH C18色谱柱（1.7 μm，

2.1 mm×100 mm）；流动相乙腈⁃水（含0.1%甲酸），梯度洗脱，程序见表1；体积流量0.2 mL／min；柱温25.4 ℃；进样量5 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2.2 质谱 电喷雾离子源（ESI），多反应监测模式（MRM）；锥孔电 压50 V；毛细管电压3.0 kV；锥孔气体积流量50 L／h；雾化气体积流量650 L／h，温度350 ℃；源温度150 ℃。定量离子对、参数见表2。

表2 各成分定量离子对、参数Tab.2 Quantitative ion pairs and parameters for various constituents

2.3 分组、给药及样品采集 10 只大鼠随机分为给药组、空白组，每组5 只，灌胃给药，剂量为1.35 g／（kg·d－1）（以肉苁蓉总苷计），空白组给予等体积蒸馏水，共6 次，每次间隔12 h，取血前12 h 禁食，自由饮水。于末次给药后0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 眼眶静脉丛取血约500 μL 至肝素化EP 管中，静置0.5 h 后12 000 r／min 离心10 min，吸取上层血浆，－20 ℃下保存。同法制备空白血浆。

2.4 血浆样品预处理 将“2.1.1”项下对照品溶液稀释至500 ng／mL，取3 份，每份20 μL，置于EP 管中，40 ℃氮气吹干，加入200 μL 空白血浆、20 μL 内标溶液，涡旋30 s 混合均匀，加入乙酸乙酯、甲醇、水饱和正丁醇各660 μL，涡旋混合3 min，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，200 μL 60%甲醇复溶，涡旋1 min，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.2”项条件下进样测定。待测成分与绿原酸峰面积之比记为A；取200 μL 空白血浆3 份，加入20 μL 内标溶液，涡旋30 s 混匀，加入乙酸乙酯、甲醇、水饱和正丁醇各660 μL，涡旋混合3 min，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，加入500 ng／mL对照品溶液20 μL，涡旋1 min，40 ℃氮气吹干，200 μL 60%甲醇复溶，涡旋1 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.2”项条件下进样测定。待测成分与绿原酸峰面积之比记为B，以A／B计算提取回收率，结果见表3，可知方法2 中各成分提取回收率均较高，故选择甲醇沉淀蛋白法进行血浆样品预处理。

表3 不同预处理方法下提取回收率（n＝3）Tab.3 Extract recoveries under different pretreatment methods（n＝3）

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 按“2.4”项下最优方法制备空白血浆供试品溶液（不加对照品、内标溶液）、模拟血浆供试品溶液（空白血浆中加入500 ng／mL 对照品、内标溶液）、给药60 min 后血浆供试品溶液（加内标溶液），在“2.2”项条件下进样测定，质谱图见图1～2，可知正离子模式下丁香苷m／z395.10 峰的保留时间为2.300 min，绿原酸m／z355.10 峰的保留时间为2.471 min；负离子模式下红景天苷m／z299.10 峰的保留时间为2.191 min，绿原酸的m／z353.00 峰的保留时间为2.476 min，毛蕊花糖苷m／z623.20 峰的保留时间为3.210 min，松果菊苷m／z785.30 峰的保留时间为2.640 min。多反应监测（MRM）离子色谱图见图3～4，可知血浆中内源性物质、代谢产物对成分测定无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 各成分质谱图（正离子模式）Fig.1 Mass spectrograms of various constituents（positive ion mode）

图2 各成分质谱图（负离子模式）Fig.2 Mass spectrograms of various constituents（negative ion mode）

图3 各成分MRM 色谱图（正离子模式）Fig.3 MRM chromatograms of various constituents（positive ion mode）

2.5.2 线性关系考察 将“2.1.1”项下对照品溶液稀释至1、10、100、200、500、1 000、2 500 ng／mL，各取20 μL，40 ℃氮气吹干，加入200 μL 空白血浆、20 μL 内标溶液，按“2.4”项下方法处理，分别制备成质量浓度为0.1、1、10、20、50、100、250 ng／mL的溶液，在“2.2”项条件下进样测定，平行3 次。以各成分质量浓度为横坐标（X），待测成分、绿原酸峰面积比值为纵坐标（Y）进行回归，以S／N ＝10 时的样品质量浓度为定量限，结果见表4，可知在各自范围内线性关系良好。

表4 各成分线性关系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度、准确度试验 按“2.5.2”项下方法制备0.5、20、200 ng／mL 模拟血浆供试品溶液作为质控样品，平行6 份，每天绘制1 次标准曲线，完成1个批次测定，以当日标准曲线计算质控样品质量浓度，连续6 d，结果见表5。由此可知，各成分日内、日间精密度RSD 为1.62%～6.38%，RE 为－6%～19.7%，满足生物样品定量分析要求。

表5 各成分精密度、准确度试验结果（n＝6）Tab.5 Results of precision and accuracy tests for various constituents（n＝6）

2.5.4 基质效应、提取回收率试验 取20 μL 内标溶液，40 ℃氮气吹干，加入200、20、0.5 ng／mL对照品溶液各200 μL，滤过，在“2.2”项条件下进样测定，待测成分、绿原酸峰面积之比计为Al；取200 μL 空白血浆，加入660 μL 甲醇，涡旋混合3 min 后12 000 r／min 离心10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，加入20 μL 内标溶液，40 ℃氮气吹干，加入3个质量浓度对照品溶液各200 μL，涡旋1 min，滤过，在“2.2”项条件下进样测定，待测成分、绿原酸峰面积之比计为A2；取3个质量浓度对照品溶液各200 μL，加入20 μL 内标溶液，40 ℃氮气吹干，再加入空白血浆200 μL、甲醇660 μL，涡旋混合3 min，12 000 r／min 离 心10 min，取上清液，40 ℃氮气吹干，200 μL 60%甲醇复溶，涡旋1 min，滤过，在“2.2”项条件下进样测定，待测成分、绿原酸峰面积之比计为A3，平行6 次，以A2／A1计算基质效应，A3／A2计算提取回收率，结果见表6。由此可知，该方法无明显基质效应，提取回收率较高，符合生物样品分析要求。

表6 各成分基质效应、提取回收率试验结果（n＝6）Tab.6 Results of matrix effect and extraction recovery tests for various constituents（n＝6）

2.5.5 稳定性试验

2.5.5.1 室温稳定性 取“2.5.3”项下质控样品，室温下放置6 h，在“2.2”项条件下进样测定。

2.5.5.2 冷冻稳定性 取“2.5.3”项下质控样品，－20 ℃下冻存7 d，在“2.2”项条件下进样测定。

图4 各成分MRM 色谱图（负离子模式）Fig.4 MRM chromatograms of various constituents（negative ion mode）

2.5.5.3 冻融稳定性 取“2.5.3”项下质控样品，－20 ℃下冻存24 h 后取出，室温下完全自然解冻，在“2.2”项条件下进样测定，再放回－20 ℃下冻存24 h 以上，重复3 次。

2.5.5.4 结果分析 上述3种试验平行6 次，结果见表7。由此可知，不同条件下各成分含量RSD均小于10%，表明样品稳定性良好，但仍应尽量减少冻融次数。

表7 各成分稳定性试验结果（n＝6）Tab.7 Results of stability tests for various constituents（n＝6）

2.6 药动学研究 将“2.3”项下血浆样品按“2.4”项下最优方法处理后，在“2.2”项条件下进样测定，通过PK Solver 2.0 软件的非房室模型绘制血药浓度⁃时间曲线，计算主要药动学参数，结果见图5、表8。

图5 各成分血药浓度⁃时间曲线Fig.5 Plasma concentration⁃time curves for various constituents

表8 各成分主要药动学参数（， n＝5）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝5）

表8 各成分主要药动学参数（， n＝5）Tab.8 Main pharmacokinetic parameters for various constituents（， n＝5）

3 讨论与结论

肉苁蓉雌激素作用是现代药理研究成果［11⁃13］，课题组前期发现，肉苁蓉总苷中松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷等13种成分是关键物质［9］，其中毛蕊花糖苷、松果菊苷是2020年版《中国药典》 肉苁蓉含量测定项下指标成分［14］。以此为基础，本实验选择松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷进行大鼠体内药动学研究，以期揭示肉苁蓉雌激素作用活性物质在体内的动态变化过程，整体实验思路与中药作用特点相契合，对传统中医药理论赋予了更现代、更科学的诠释，不仅有助于中药质量控制和评价方法的完善，而且对临床合理用药、新药研发具有重要意义。

本实验采用UPLC⁃MS／MS 法检测松果菊苷、丁香苷、红景天苷、毛蕊花糖苷血药浓度，其超低检测限更符合体内样品含量较低的实际检测需求。仪器灵敏度往往也是影响药动学实验结果的重要因素之一［15］，与传统的HPLC 法相比，UPLC⁃MS／MS 法优势不仅体现在灵敏、快速、高效、节约成本，最重要的是数据更准确，更能真实反映雌激素活性成分血药浓度的动态变化过程。结果显示，给药后各成分在30～90 min 之间均达到最大血药浓度，其中丁香苷、松果菊苷下降迅速，半衰期在2 h左右，而毛蕊花糖苷、红景天苷相对较慢，半衰期在4～5 h，整体表现为吸收、消除速度均较快，以期为肉苁蓉雌激素作用的深入研究提供依据。