昆明地区儿童流感嗜血杆菌分型研究

杨俊逸 袁 梅 张建英 徐 华 黄海林

（昆明市儿童医院检验科，云南省昆明市 650103）

流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae，Hi）是儿童社区获得性感染的重要病原菌，常引起非侵袭性感染（呼吸道感染）和侵袭性感染（菌血症、脑膜炎等），严重危害儿童健康[1]。不同地区和人群Hi的分型结果不同，而细菌分型是疾病流行病学和疫苗研发的重要基础。本文通过分析104株Hi标本，并对其进行生物学分型和血清荚膜分型，以了解昆明地区儿童流感嗜血杆菌流行类型情况，具体如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2018年1月至2020年12月，昆明市儿童医院经ATB细菌药敏分析仪（厂家：法国梅里埃，型号：ATB1525EXPRESSION、质控菌株为Hi标准菌株ATCC49766）诊断为Hi感染的患儿标本，去除同一患儿的重复标本，共104株，包括87份痰、4份血、4份肺泡灌洗液、4份脓液、1份脑脊液、4份分泌物（眼结膜、伤口）标本。研究取得患儿父母或法定监护人同意并签署知情同意书，经院内医学伦理委员会审核批准。纳入标准：①6个月～5岁儿童；②伴不同程度呼吸道感染症状；③诊断为Hi感染的患儿[2]。排除标准：①无法配合患儿；②近期应用抗生素患儿。

1.2 方法 ①菌株的分离培养和鉴定。巧克力平皿上挑取可疑菌落，经卫星试验初步筛选后，采用全自动微生物鉴定仪（法国梅里埃，型号：Vitek-2-compact 60）确诊为Hi。严格按照《全国临床检验操作规程》[3]第4版操作。②生物学分型。根据Hi对靛基质、吲哚、鸟氨酸脱羧酶生化反应管（杭州滨和微生物试剂有限公司，批号：210104，规格：20支装）反应结果的差异，可以将Hi分为Ⅰ（+、+、+）、Ⅱ（+、+、-）、Ⅲ（-、+、-）、Ⅳ（-、+、+）、Ⅴ（+、-、+）、Ⅵ（-、-、+）、Ⅶ（+、-、-）、Ⅷ（-、-、-、）共8个生物型。③血清荚膜分型。血清学分型采用玻片凝集法，取5uL Hi菌悬液和等量荚膜型特异性抗血清（日本DENKA SEIKEN株式会社，批号：748106，规格：2 mL×6）混匀，1 min内出现凝集为对应的Hia-Hif荚膜型，不凝集则为无荚膜不可分型（Non-typeable H.influenzae，NTHi）。

1.3 统计学分析 计数资料以例数或百分比表示，对分型结果与标本关系数据统计结果进行定性分析。

2 结果

2.1 生物学分型结果 104株Hi中，生物型占比由高到低依次是：Ⅱ型47株（45.2%）、Ⅲ型40株（38.5%）、Ⅰ型8株（7.7%）、Ⅳ型5株（4.8%）、Ⅵ型3株（2.9%）、Ⅴ型1株（1.0%）。Ⅱ型和Ⅲ型最常见，其他生物型不多见，Ⅶ和Ⅷ型均未检出。

2.2 血清荚膜型分型结果 血清荚膜型分型中，93株（89.4%）为不可分型流感嗜血杆菌（nontypeable Haemophilus influenza，NTHi），11 株（10.6%）为荚膜型，包括Hib型6株（5.8%）、Hie型3株（2.9%）、Hic型和Hif型各1株（1.0%）。

2.3 分型与标本来源的关系 Hi生物学分型、血清荚膜型分型结果与标本关系如表1所示。NTHi标本来自痰、血、肺泡灌洗液、脓、分泌物。Hib标本来自痰、血、脓、脑脊液。I型主要来自脓、脑脊液、血。眼分泌物均检出Ⅱ型。来源于血、脑脊液的4株Hib均同为生物型Ⅰ型。其余血清荚膜型和生物型的关系不明显。

表1 流感嗜血杆菌分型与标本来源的关系（株）

3 讨论

流感嗜血杆菌为革兰阴性短小杆菌，是5岁以下儿童社区获得性感染重要致病菌，主要引起呼吸道感染，此外还可导致菌血症、关节炎、蜂窝织炎、中耳炎、鼻咽炎、脑膜炎等疾病。

国内外不同地区不同人群流行的Hi生物型各不相同。根据Hi对靛基质、吲哚、鸟氨酸脱羧酶生化反应管反应结果的差异，可分成Ⅰ～Ⅷ共8种生物型。本研究显示，Ⅱ型和Ⅲ型占比83%以上，是本地区最主要的流行生物型。但根据不同研究，昆明地区成人以Ⅲ型和Ⅳ型为主[4]；成都地区以Ⅰ和Ⅳ型为主[5]；而上海地区儿童以Ⅲ型为主[6]。据文献报道，不同生物型引起的疾病也不同，Ⅰ型常引起儿童急性下呼吸道感染和脓毒血症，Ⅱ型引起呼吸道爆发性疾病，Ⅲ型引起组织蜂窝织炎，Ⅳ型引起新生儿败血症[7]。本研究结果显示：血、脑脊液标本中检出Hib同时也检出Ⅰ型生物型，且Ⅰ型主要来自脓、脑脊液、血标本，说明Hib与I型可能存在一定关联，以及Ⅰ型侵袭力较强容易导致脓毒血症、脑膜炎；组织蜂窝织炎常见标本伤口分泌物、脓液中检出Ⅲ型，说明Ⅲ型可引起该类疾病发生；眼分泌物标本均检出Ⅱ型，可能与眼结膜炎有关，与上文所提到的文献报道不一致，原因可能与标本量较小有关，需要格外关注。

我国流感嗜血杆菌以无荚膜不可分型NTHi为主，但不同地区血清荚膜型构成比有差异[8]。根据荚膜多糖抗原不同，流感嗜血杆菌可分为a、b、c、d、e、f 6个荚膜血清型和无荚膜不可分型NTHi。本研究显示，NTHi占比约90%而成为本地区优势血清型，而本研究中的NTHi标本来自痰、脓、血、分泌物等，说明NTHi主要会引起呼吸道非侵袭性感染，也可引起脓毒血症等侵袭性感染；荚膜型仅占10%。文献报道Hib型致病性和毒力最强，常引起肺炎、菌血症等严重疾病[9]。本研究中Hib型标本来源于痰、血、脓、脑脊液，证实了此观点。Hif致病力其次，本文中Hif感染患儿被诊断为重症肺炎。本次试验中，观察到Hie标本均来自痰，且菌落形态不是光滑露滴状而是黏液型，值得我们注意。总之，自Hib疫苗推广以来，高致病力的b型流感嗜血杆菌发病率明显降低，与此同时，NTHi型流感嗜血杆菌成为主要流行血清型。因此，NTHi型疾病预防和疫苗研发十分重要。

综上所述，流感嗜血杆菌是儿童社区获得性感染的重要致病菌。昆明地区儿童可检出Ⅰ～VI型，但以Ⅱ型和Ⅲ型为主，不同生物型呈现出关联疾病，Ⅰ型可引起脓毒血症，Ⅲ型可引起组织蜂窝织炎。另外，本地区主要流行NTHi型会引起呼吸道非侵袭性感染，也能引起菌血症、组织蜂窝织炎等严重侵袭性感染。Hib等荚膜血清型虽然检出率较低，但容易导致脓毒血症，仍需警惕。