■张宏福 夏 冰 陈 亮 钟儒清 王云龙
(1.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,动物营养学国家重点实验室,北京 100193;2.山东保安康生物技术有限公司,山东临沂 273300)
益生菌(Probiotics)是一类定植于宿主肠道、生殖系统,并对宿主产生有益功效的活性微生物总称[1]。益生菌主要分为三类:乳酸菌、芽孢杆菌和酵母菌。乳酸菌是一类以乳酸为主要代谢产物的革兰氏阳性菌[2],主要包括乳酸杆菌、乳球菌、链球菌和双歧杆菌等菌属[3]。乳酸菌在抵御致病菌、增强免疫力、促进肠道生态平衡及维护肠道健康方面发挥重要作用,已经被广泛应用于食品、生物工程及生命健康等领域[4-6]。然而,大量使用活菌引起的安全问题如细菌感染、抗生素耐药基因的产生及超敏反应等已经逐渐引起人们的关注[7]。相较于活菌,灭活乳酸菌安全性更高,且具有多种相同的生理功能,只是两者发挥作用的机理有所不同。灭活乳酸菌具有吸附毒素、黏附颉颃致病菌、增强免疫力及使用便捷等优势,在动物生产中具有较大的应用潜力。然而,目前灭活乳酸菌在我国畜牧行业中应用仍然较少,主要是对其生理作用及机制尚不清晰,以及尚不明确在饲粮中的适宜添加量。因此,本文旨在综述灭活乳酸菌的生理功能及其作用机制,并综述其在国内外畜禽生产中的应用效果,从而为灭活乳酸菌的进一步开发和利用提供理论指导。
乳酸菌灭活主要分为物理和化学两种方式。物理方式包括:热灭活、高压灭活、紫外照射、γ-射线照射、反复冻融及超声波灭活;化学方式包括:甲醛、乙醇、酸或碱灭活。其中,热灭活方式是目前应用最为广泛的一种[8-9]。
益生菌活菌的安全性问题已经引起人们的关注,Wagner等[10]研究报道,活菌的基因突变、非正常部位转移以及耐药性基因的产生都可能增加菌体致病的风险,特别是针对免疫力低下或免疫缺陷的病人,服用益生菌活菌制剂极易出现病理反应。在免疫缺陷小鼠体内定植乳杆菌、双歧杆菌和嗜酸乳杆菌,结果发现定植了乳杆菌的小鼠出现死亡现象,同样患有免疫缺陷的成年小鼠也出现了死亡[10]。对比之下,乳酸菌灭活之后不会在宿主体内生长繁殖,具有更高的安全性。
乳酸菌活菌对保存和运输条件以及保质期有严格的要求,目前市场上大部分活菌益生菌均需在低温(4℃)下运输和保存,保质期也仅为几天至十几天。另一方面其进入消化道内,很容易受到胃酸、胆汁及消化酶等的影响,不能到达肠道发挥作用[11]。相比较而言,灭活乳酸菌不受环境温度影响,具有耐高温的特性,能顺利进入宿主肠道并黏附于肠道上皮,竞争排斥致病微生物,从而保护肠道[9]。
在使用过程中,灭活乳酸菌制剂对菌的数量没有限制。而活菌制剂通常须达到一定数量的活菌数才可发挥疗效。有研究指出使用益生菌活菌时,要获得预期的结果,食品中活菌最低添加数量在106CFU/g或最低平均日摄入量为108CFU/g,以补偿活菌在通过胃肠道过程中的消耗,能够提供足够活细胞定植于宿主肠道[11]。然而若过量添加又可能引起一些不良反应,因此益生菌活菌制剂使用量较难控制。此外,灭活乳酸菌也可直接加入动物饮水中,使用便捷。
活菌制剂不能和抗生素联用,抗生素在杀死致病菌的同时也会杀灭益生菌活菌,导致宿主正常菌群失调,引发一系列不良反应。灭活乳酸菌可与抗生素、丁酸盐及其他活菌制剂等合用,不会出现敏感反应[12]。
图1 灭活乳酸菌的主要生理功能
灭活乳酸菌在吸附霉菌毒素、抑制病原微生物及改善肠道健康等方面均具有有效性,这与其黏附颉颃作用有关。在吸附霉菌毒素方面,Pierides等[13]选取几株乳酸菌用来研究其对黄曲霉毒素的吸附作用,结果发现无论是活菌还是热灭活乳酸菌都能减少PBS液中黄曲霉毒素的含量,其中两株鼠李糖乳杆菌(LBGG和LC-705)表现出极强的吸附能力,进一步研究其在全脂和脱脂牛奶中的吸附作用,发现与活菌相比,热灭活LBGG吸附能力更强、结合更稳定。Hatab等[14]也发现热灭活乳酸菌可同样有效地去除苹果汁中的展青霉素。一方面,乳酸菌与霉菌毒素的结合机制是细胞壁肽聚糖与毒素之间的非共价键,灭活处理破坏了乳酸菌细胞壁的完整性,肽聚糖的交联被打破,孔径增加,因此毒素除了与细胞壁结合之外,还可与细胞壁内的原生质膜结合,从而增加灭活乳酸菌对毒素的吸附能力[15-16]。另一方面,也有研究提出,灭活乳酸菌细胞壁组分肽聚糖的物理结构及邻位羟基和羧基并非吸附毒素的主要作用因素,而碱性氨基酸、硫醇和酯类化合物在吸附过程中发挥重要作用。并且,氢氧化钠和酯化预处理乳酸菌可以显著提高其吸附能力[17]。
黏附通常是病原菌入侵宿主的第一步,而益生菌也可通过黏附素与肠道黏膜上皮受体结合,通过竞争性黏附以阻止病原菌的定植,从而起到占位保护作用[18]。Hirano等[19]研究表明,植物乳杆菌在脑心浸出液培养基中能显著抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长,进一步通过细胞试验发现其能够通过空间占位作用,与沙门氏菌竞争共同黏附位点,从而减少致病菌对HT-29细胞的黏附。有研究表明,将沙门氏菌感染口服灭活乳酸菌的小鼠,6 d后经检测发现,肝脏和脾脏中病原菌数量显著降低,表明灭活乳酸菌在体内也能抑制致病菌的黏附和增殖[20]。通过扫描电镜发现,胃中幽门螺旋杆菌的形态在灭活乳酸菌的作用下由螺旋状变为弯曲状和球状,表明灭活乳酸菌可通过改变致病菌正常结构和形态抑制其在宿主体内的增殖和定植[21]。正常情况下,肠道菌群栖息于结肠的外黏液层,紧贴肠道上皮的内黏液层几乎无细菌存在,仅有特定类型的细菌(如变形菌门)能穿过内黏液层与上皮细胞结合[7]。因此与活菌相比,灭活破坏了乳酸菌细胞壁完整性,细胞壁成分如脂磷壁酸和胞外多糖等释放出来,有效地穿过黏液层到达肠道上皮,增强肠道黏膜的完整性。同时也促进细菌素和乳酸菌等抗菌物质的分泌,表现出较强的颉颃特性[22-23]。
正如上文所述,由于黏液层的保护作用,益生菌活菌很难接近肠道上皮细胞调控免疫反应。而灭活乳酸菌及其代谢产物能直接穿过黏液接触肠道上皮,刺激免疫细胞的分泌能力。过度肥胖的人连续12周摄入热灭活植物乳杆菌后免疫力增强,血清中胆固醇水平下降[24]。灭活益生菌及其菌体成分的靶标主要是巨噬细胞和B淋巴细胞。灭活乳酸菌能激活巨噬细胞并促进其分泌多种具有杀死肿瘤功能的细胞因子(如TNF-α、IL-6、IL-10和IL-12等),增强机体非特异性免疫能力[25-26]。乳酸菌的组分主要是通过识别并结合模式识别受体如NOD样受体和TLR家族以调控细胞因子的产生[27]。TLR2识别革兰氏阳性菌上特定相关分子模式,募集信号后使下游转录因子NF-κB从IκB/NF-κB复合物中释放,转移至胞内促进相关炎性因子的产生[28]。TNF-α诱导Caco2细胞内NF-κB入核、抑制胞浆中IκB的表达而引发炎症反应,研究发现热灭活乳酸菌可通过影响NF-κB/IκB信号通路降低促炎细胞因子IL-8的产生,进而发挥抗炎特性[29]。Rocha-RAMíREZ等[25]利用TLR2抗体和激动剂Pam3CSK4分别作用于巨噬细胞,发现热灭活乳酸菌依赖于TLR2信号途径刺激巨噬细胞的分泌和吞噬能力,发挥免疫调控作用。IL-6是一种多效细胞因子,主要由单核巨噬细胞及Th2细胞产生,在诱导炎症反应、免疫调节和癌症发生发展方面具有重要作用[30]。STAT蛋白家族在调节细胞因子依赖性炎症和免疫方面发挥关键作用,其中STAT3因参与多种促炎细胞因子和细胞内信号转导通路而备受关注,STAT3的过度激活可通过肿瘤自主机制直接促进肿瘤生长,也可通过调节肿瘤相关间质和免疫系统的抗肿瘤反应间接促进肿瘤生长[30],炎症刺激下过度释放的IL-6可活化JAK1,促使STAT3的磷酸化和转录激活。而肿瘤细胞中STAT3的过度激活也会诱导IL-6的产生。DSS诱导的结肠炎小鼠IL-6、STAT3和p-STAT3表达量增高,而经热灭活乳酸菌后其表达量显著降低,表明灭活乳酸菌能通过抑制IL-6/STAT3信号通路缓解DSS诱导的小鼠结肠炎[31]。
在结构上,肠道黏膜屏障由具备一定厚度的细胞外黏液层和肠道上皮细胞组成,在抵御微生物和外源性抗原方面起着重要作用。热灭活乳酸菌能够通过改善炎症小鼠肠道组织形态缓解肠道损伤。紧密连接是一类具有黏附性的多蛋白复合物,通过封闭细胞间隙来调节屏障的通透性,是决定肠道跨上皮转运速度和黏膜通透性的主要因素[32]。多项研究表明,灭活乳酸菌能通过增加炎症模型小鼠肠道紧密连接蛋白ZO-1和Claudin1等的表达量来提高肠道屏障功能的完整性,以缓解肠道损伤[33-34]。肠道杯状细胞分泌的黏蛋白与水、无机盐等形成了肠黏膜表面的黏液层,其与肠道上皮细胞、肠道微生物和免疫系统相互作用,共同维持肠道内环境的稳态[35-36]。Wang等[37]研究发现,热灭活乳酸菌能够显著上调小鼠十二指肠、回肠和结肠中MUC2的表达量,同时增加了粪便中黏蛋白的含量,经PAS染色发现热灭活乳酸菌通过增加杯状细胞的数量和体积以促进黏蛋白的表达和分泌。其作用机制是灭活乳酸菌细胞壁成分脂磷壁酸与TLR2结合后激活下游p38-MAPK信号通路促进黏液分泌,同时抑制NF-κB及促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的表达以缓解炎症反应,最终改善宿主肠道健康[37]。
健康状态下,肠道菌群维持在一个动态平衡状态,各种菌丰度在一定范围内维持相对稳定,然而受到外界刺激后,这种稳定的平衡关系被打破,便可能导致肠道菌群失调。肠道菌群对宿主生理功能的影响主要体现在宿主代谢、免疫系统及黏膜屏障功能方面[38]。王然等[39]在便秘患者中测试普通常温酸奶和灭活型副干酪乳杆菌润肠通便的作用,结果发现灭活副干酪乳杆菌能够显著增加受试者粪便中产短链脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)的菌属如Blautia、Ruminococcus_2和Eubacterium_hallii_group等的丰度,同时粪便中丙酸、丁酸和总SCFA的含量,受试者排便次数也显著增加,表明灭活乳酸菌通过调整肠道菌群及其代谢产物实现润肠通便的作用。Wang等[37]研究发现,灭活乳酸菌能通过增加黏液利用菌Akkermansia muciniphila的丰度促进黏蛋白的表达和分泌,进一步通过粪菌移植研究发现接受了来自饲喂灭活乳酸菌小鼠粪便的个体肠道中黏蛋白的表达和分泌显著增加,表明灭活乳酸菌通过调控微生物增强黏液屏障的功能。
肠-肝生理轴是指肠道和肝脏之间密切的解剖学和功能关系。该机制通过血液循环将肠道中营养物质和肠道抗原等通过门静脉运输至肝脏,肝脏又提供给肠道胆汁、蛋白质和脂质等成分[40]。一旦肠道受损便使肝脏直接暴露于肠源性内毒素环境中,反之,肝脏生理学遭到破坏也可能导致肠道功能障碍。该过程受饮食、遗传和环境因子等多种因素共同影响[41]。研究发现热灭活嗜热乳酸链球菌降低糖尿病大鼠空腹血糖和总胆固醇水平,同时缓解葡萄糖不耐受症状,进一步研究发现该作用与热灭活乳酸菌增强肠道黏膜屏障功能及提高有益菌(如Ruminococcaceae、Veillonella、Coprococcus和Bamesiella)相对丰度有关[42]。此外,灭活乳酸菌还能减少肥胖模型鼠肝脏中脂肪沉积,显著降低小鼠的体重[37]。肠-脑生理轴是联系消化道和中枢神经系统的通路,具有双向调节作用[43]。肠道菌群分泌的信号分子可通过肠-脑生理轴影响大脑认知和行为功能。研究发现口服灭活乳酸菌的小鼠结肠中五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的表达增加,和结肠内容物中5-HT也显著增加[44]。在中枢神经系统中,5-HT作为一种广泛存在的抑制性神经递质,参与情绪、食欲、睡眠等神经活动的调节,与情感性精神障碍、焦虑症、精神分裂症及孤独症的发生都有一定的关系[45]。Wang等[37]将热灭活乳酸菌加入老龄肥胖小鼠的饮水中,研究发现与对照组相比,热灭活乳酸菌组肠道菌群的多样性、丰富度及组成均改变,通过行为测试发现小鼠的焦虑样行为降低及记忆力增加。Warda等[46]也发现灭活乳酸菌能降低小鼠基质皮质酮的水平。皮质酮是由肾上腺皮质分泌的糖皮质激素,皮质酮的过量产生会引起抑郁样行为的增加[47]。此外还发现尽管灭活乳酸菌对小鼠粪便微生物整体影响微弱,但与社会行为相关的菌属发生显著变化,从而改善了小鼠的行为能力[46]。除此之外,肠-脑生理轴还能通过下丘脑协同肠道激素参与调节动物食欲。胃促生长素又叫胃饥饿素,是由胃内的肠内分泌细胞产生,是已知唯一能够刺激食欲的循环因子。灭活乳酸菌能通过促进酰基胃促生长素的分泌以及相关基因Syt3的表达,从而提高大鼠的食欲,增加其采食量[48]。
在家禽饲粮中添加灭活乳酸菌能促进家禽肠道吸收功能,提高免疫力,改善家禽生长性能。赵巍等[49]研究表明,在肉仔鸡基础饲粮中分别添加0.8%、1.6%、3.2%和6.4%的灭活植物乳杆菌培养物,6.4%的添加量可显著增加肉仔鸡平均日增重和料重比,1.6%的添加量可显著增加肉仔鸡平均日增重和盲肠中双歧杆菌数量。这与王欣[50]的研究结果一致,其结果表明在肉仔鸡饲粮中添加灭活植物乳杆菌菌液对肉仔鸡的平均日增重和饲料转化效率提高显著,同时促进了肉鸡的免疫功能。付丽[51]发现,在肉鸡饲粮中添加灭活乳酸菌培养物能显著提高免疫器官指数,增加血清中免疫球蛋白含量,提高生长性能,并发现在肉鸡生产中使用一定量的灭活乳酸菌替代金霉素,可获得更好的经济效益。Incharoen等[52]也发现,10 mg/kg热灭活植物乳杆菌L-137能提高脾脏中细胞因子IL-12β、IFN-β和IFN-γ的表达,提高肉鸡免疫能力,在替代抗生素类促生长物质方面具有较大潜力。
小肠是营养物质消化吸收的主要部位,肠道稳态是通过肠道干细胞的增殖分化实现的,肠道上皮细胞由隐窝向上迁移至绒毛,逐渐分化成熟并最终在绒毛顶端脱落[53]。Khonyoung等[54-55]研究发现,在肉鸡饲粮中添加热灭活乳酸杆菌能够促使肠道绒毛顶端突起细胞肥大,促进上皮细胞的增殖与更新,增加对营养物质的消化和吸收,从而提高肉鸡生长性能。灭活乳酸菌还可与其他益生菌制剂配伍使用。Zhu等[56]在黄羽肉鸡饲粮中添加热灭活嗜酸乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合物能够增加Barnesiellaceae,Barnesiella和Lactobacillus aviaries的丰度,降低Lachnoclostridium和Peptococcus的丰度,调节肠道微生物的组成结构,维持肠道菌群的生态平衡,同时增加饲料转化效率而降低血清中胆固醇和肌苷酸的含量,提高肉鸡生长性能。目前,关于灭活乳酸菌与其他添加剂协同作用的研究较少,其适宜添加量和应用效果还需进一步研究。
仔猪消化道发育不完善,对环境中致病菌抵抗力不足,断奶时易发生腹泻。在仔猪饲粮中添加灭活乳酸菌能够提高猪的免疫抗病能力,降低仔猪腹泻率。Kang等[57]研究发现,饲粮中分别添加0.1%、0.2%和0.4%的热灭活乳酸菌均能降低血清中TNF-α、TGF-β和皮质醇的浓度,提高仔猪的免疫力,从而降低仔猪腹泻率。Arimori等[58]在仔猪饲粮中分别添加灭活乳酸菌和抗生素,结果发现两者均能提高仔猪生长性能,然而在先天免疫方面,与抗生素相比,灭活乳酸菌能显著提高仔猪IFN-β的表达、中性粒细胞数量以及中性粒细胞与淋巴细胞的比例,这表明灭活乳酸菌在提高仔猪免疫能力方面可能优于抗生素。IFN是一种高活性多功能的细胞因子,除具有调节机体免疫系统功能外,还具有抗病毒活性[59]。有研究表明,灭活植物乳杆菌能够通过诱导小鼠血清中IFN-β的产生,降低小鼠肺部病毒效价,延长小鼠的存活时间[60]。尽管灭活乳酸菌抗病毒的机制尚不明确,但可为应对“非洲猪瘟”这一畜牧业难题提供一个重要思路。此外,灭活乳酸菌还能通过促使仔猪血清和粪便中免疫球蛋白A(IgA)的分泌提高免疫抗病能力[61]。TSUKAHARA等[62]研究了灭活乳酸菌的不同饲喂方式对仔猪生长性能的影响,发现无论是灌服(10 mg/kg)还是在饲粮中添加(0.05%)均能增加仔猪肠道空肠绒毛高度,提高其对营养物质的吸收和利用,从而提高生长性能。
灭活乳酸菌作为哺乳犊牛的乳代替品,7 d后发现其血清葡萄糖和维生素A水平显著增加,在第21 d时粪便中大肠杆菌数量显著降低,而乳酸菌数量显著增加,同时降低了整个周期内犊牛的医疗次数[63],这表明灭活乳酸菌能够增强犊牛免疫机能,另外可促进有益菌群的定植及抑制有害菌的增殖,有利于犊牛的肠道健康。由于反刍动物特殊的消化器官,目前灭活乳酸菌在反刍动物中的研究仍然较少,还需着重探究灭活乳酸菌对反刍动物胃肠道健康的调控机理以及作为添加剂的应用价值。
综上所述,灭活乳酸菌具有黏附抗性、增强免疫能力和肠道黏膜屏障功能等多种生理功能。且灭活乳酸菌安全性高,不会造成细菌感染,尤其适用于畜禽幼龄阶段。在畜禽饲粮中添加灭活乳酸菌能够促进肠道对营养物质的吸收和利用,提高机体免疫力和生长性能。目前,灭活乳酸菌在畜禽生产中的研究应用还相对缺乏,而限抗替抗已是全球畜牧业发展的必然趋势,因此迫切需要进一步开发新型有益灭活乳酸菌,以饲料来源、肠道菌群和畜禽健康状态为基础进行综合评估,精准的检测使用方案是应用灭活乳酸菌维护畜禽健康的关键。