三七超低温破壁粉质量标准研究

黄冬芳 韦金玉 梁 洁,2,3 陈辉华 祁金丽 胡 珏 刘 民 赵立春,2,3

1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，广西南宁 530200；3.广西优势中成药与民族药开发工程技术研究中心，广西南宁 530200；4.广西桂盛合中药制药有限公司，广西南宁 532100

三七为五加科植物三七Parmx notoginseng（Burk.）F.H.Chen的干燥根和根茎[1]，三七是我国贵重中药，具祛瘀、止血、滋补等作用[2-3]。三七粉、三七片、熟三七和熟三七粉是三七现有的饮片规格[4-5]；而三七粉既是目前最常用的饮片形式，也是临床上最常应用的粉末规格[6-8]。粒径是影响有效成分溶出的关键因素[9]，中药材经粉碎成细粉后减小粒径，由此可提高生物利用度[10]。超微粉碎技术是近年兴起的一种新型技术，可增加药材的细胞破壁率，明显提高有效成分的溶出[11-14]，有利于与给药部位直接接触[15]。2018 年云南省发布了呈冻干物质状态的三七、三七粉、三七切片的中药饮片炮制规范，表明真空冷冻干燥技术已开始应用于三七的炮制，且可以有效地保存药效成分[16-17]。真空冷冻干燥技术，指在超低温条件下及真空状态下获得的一种物质状态，能保持药物的原有特性，提高其稳定性[18-19]。

三七粉可内服和外用[20]，外用于止血，吞服可用来防治高血压，对于身体衰弱、食欲不振等症状也有一定的功效[21-24]。现代临床上常将三七粉用于止血、治疗肝损伤、防治冠心病、增强免疫力[25-27]。三七超低温破壁粉首先是用真空冷冻干燥技术将药材进行超低温干燥，再通过破壁技术的加工而得到的。与普通的三七粉比较，处理后的三七超低温破壁粉利用价值提升，细胞、组织破壁可增大有效成分的溶出速度和溶出度，同时还具有细度稳定、不易团聚的优势。目前，超微三七粉质量标准的相关研究较多，但关于三七超低温破壁粉质量控制方面的显微鉴别和薄层鉴别研究尚少见，本研究开展三七超低温破壁粉的较为全面的质量研究，为建立三七超低温破壁粉的质量标准提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

SQP 电子分析天平（万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司）；DHG9240A 电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；TGL-16G 高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ZF-7型暗箱式三用紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）；AFZ-1001-U 艾科浦超纯水系统（重庆颐洋企业发展有限公司）；硅胶G 板（青岛海洋化工有限公司）；HH-S4 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；BT224S 光学生物显微镜（厦门麦克奥迪实业有限公司）；Waters e2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）。

1.2 试药

10 批三七超低温破壁粉（广西桂盛合中药制药有限公司，批号：20200301、20200302、20200303、20200501、20200502、20200503、20200601、20200602、20200603、20200701）；对照品[人参皂苷Rb1（批号：wkq19012107-wkq20010707）、人参皂苷Rg1（批号：wkq19040208-wkq20022711）、三七皂苷R1（批号：wkq19043009-wkq20022804）]均来源于四川省维克奇生物科技有限公司，纯度≥98%；乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状特征

10 批三七超低温破壁粉粉末的粗细程度、颜色、气味等形状特征基本一致，均为灰黄色的粉末，气微，味苦回甜。

2.2 显微特征

取本品粉末适量，加水合氯醛透化后制成蜡片，于显微镜下观察，发现其薄壁细胞碎片众多，偶见完整细胞。淀粉粒甚多，单粒圆形、半圆形或圆多角形，直径4～30 μm；复粒由2～10 余分粒组成。树脂道碎片直径21～165 μm，含黄色分泌物。导管为梯纹导管、网纹导管及螺纹导管，碎片长20～280 μm，直径15～55 μm。木薄壁细胞团偶见，长95～160 μm，宽45～85 μm。草酸钙簇晶少见，直径50～80 μm。见图1。

图1 三七超低温破壁粉显微特征图

2.3 薄层色谱鉴别

取本品粉末0.5 g，加水5 滴，搅匀，加水饱和的正丁醇5 ml，密塞，振摇10 min，离心，取上清液，加3 倍量正丁醇饱和的水，摇匀，放置使分层，取正丁醇层，蒸干，残渣加甲醇1 ml 使溶解，作为供试品溶液。

另取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及三七皂苷R1，加甲醇制成每1 ml 各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷:乙酸乙酯:甲醇:水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸溶液（1→10），105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；置紫外光灯（365 nm）下检视，显相同的荧光斑点。10 批样品按照上述方法进行检验，10 批样品与对照品均有相似的斑点，薄层鉴别见图2。

图2 10 批样品的薄层色谱图

2.4 水分、灰分及浸出物检测

参照2020 版《中华人民共和国药典》（四部）[28]通则水分测定法、灰分测定法、浸出物测定法对样品进行测定，结果见表1。结合实际应用，初步拟定本品水分不得过12%，总灰分不得过4%，酸不溶性灰分不得过2%，醇浸出物含量不得少于15%。

表1 三七超低温破壁粉的水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇浸出物测定结果（%）

2.5 含量测定

2.5.1 色谱条件 Syncronis C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱，洗脱程序为（0～12 min，19%B；12～60 min，36%B，60～65 min，38%B）；进样量为10 μl；柱温为30℃；流速为0.8 ml/min；检测波长为203 nm。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。

2.5.2 混合对照品溶液制备 精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1适量，加甲醇制成每l ml含人参皂苷Rg10.5033 mg/ml、人参皂苷Rb10.5667 mg/ml、三七皂苷R10.1958 mg/ml的混合溶液，即得。

2.5.3 供试品溶液制备 取三七超低温破壁粉（批号：20200501）约0.6 g，精密称定，精密加入甲醇30 ml，称定重量，放置2 h 后，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。对照品及三七超低温破壁粉高效液相色谱图见图3。

图3 混合对照品及三七超低温破壁粉高效液相色谱图

2.5.4 线性关系考察 精密称取三七皂苷R12.35 mg、人参皂苷Rg16.04 mg、人参皂苷Rb16.8 mg，分别制成0.7833、2.0133、2.2667 mg/ml的贮备液。精密吸取三七皂苷R1贮备液适量，制成一系列浓度为0.0196、0.0979、0.1958、0.3917、0.5875、0.7833 mg/ml，精密吸取人参皂苷Rg1贮备液适量，制成一系列浓度为0.0503、0.2517、0.5033、1.0067、1.5100、2.0133 mg/ml，精密吸取人参皂苷Rb1贮备液适量，制成一系列浓度为0.0567、0.2833、0.5667、1.1333、1.7000、2.2667 mg/ml，注入高效液相色谱仪，以浓度（mg/ml）为横坐标X，峰面积积分值Y 为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表2。

表2 线性关系实验结果

2.5.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μl，按照“2.5.1”项下色谱条件进行测定，重复进样6 次，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD 值分别为1.62%、1.55%、1.62%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.6 重复性试验 取三七超低温破壁粉（批号：20200501）6 份，按“2.5.3”项下方法配制成供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进行测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的RSD 值分别为2.62%、2.65%、2.55%，结果表明本方法具有较好的重复性。

2.5.7 稳定性试验 取三七超低温破壁粉（批号：20200 501）按“2.5.3”项下方法配制成供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件分别在0、2、4、8、12、24 h 进行测定，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1峰面积的RSD 值分别为2.52%、2.41%、2.91%，结果表明样品溶液在24 h 内稳定。

2.5.8 加样回收试验 精密称取已知含量的三七超低温破壁粉（批号：20200501）6 份，加入相应量（1∶1）的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1，按“2.5.3”项下方法处理后，按“2.5.1”项下色谱条件进行含量测定，计算回收率，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的平均加样回收率分别为102.8%、97.2%、96.0%，RSD 分别为1.59%、1.48%、1.45%。

2.5.9 样品的含量测定 取10 批样品，每批样品平行测定3 次，按“2.5.3”项下方法制备，按“2.5.1”项色谱条件进行测定，含量测定的结果见表3。

由表3 可知，样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量分别在0.62%～0.64%，3.07%～3.96%，2.25%～2.49%，按干燥品计算，10 批三七超低温破壁粉中每批含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总量在6.15%～6.88%，每批总量均≥6.00%，故建议按干燥品计算三七超低温破壁粉含三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的总量不得少于6.00%。

表3 10 批样品含量测定结果（%）

3 讨论

在薄层鉴别的考察中，尝试过同时鉴别4 种皂苷成分，人参皂苷Re 和三七皂苷R1的Rf 值相近，很多展开系统难以分开，结合本研究中的含量测定指标成分有人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1，考虑到薄层鉴别与含量测定尽量选择一致的指标性成分进行研究，能更好、更精准地进行质量控制。故最后只选用了人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1作为对照品进行薄层的鉴别。

对于色谱条件的选择，参考2020 年版《中华人民共和国药典》一部[1]中三七的含量测定项下色谱条件，但经过考察，最终选择流速为0.8 ml/min，在该流速下色谱峰分离度最佳；且对洗脱梯度进行了调整，因人参皂苷Rb1出峰时间很靠后，故将梯度洗脱的时间延长至65 min，保证各个峰都能有较好的分离效果。

真空冷冻干燥技术和破壁技术的相结合是为顺应中医药现代化的需要而发展起来的一种新型药材加工技术，真空冷冻干燥技术可最大程度地保持药材的营养价值；对药材进行破壁处理，有效成分能实现更大的利用价值，但其粉体性质发生了某些变化，这些变化可能会对三七超低温破壁粉的质量有影响。因此，开展对三七超低温破壁粉质量标准研究，可进一步完善三七超低温破壁粉的质量标准。本研究所建立的方法简便、准确且可靠，可以作为三七超低温破壁粉的质量控制方法。