基于网络药理学探讨女贞子治疗肝癌的机制

张 飞 刘杰民 赵 琦

1.贵州中医药大学研究生院，贵州贵阳 550025；2.贵州省人民医院消化内镜科室，贵州贵阳 550002；3.贵州中医药大学第二附属医院消化内科，贵州贵阳 550003

在当今世界范围内，肝癌是最为常见的致命性恶性肿瘤[1]。肝癌的主要病因包括肝炎病毒的感染、黄曲霉素、饮水污染及遗传因素等[2]。根据肝癌的临床表现，中医学认为其属于“积聚”“鼓胀”等疾病，传统的中医药治疗广泛应用于临床肝癌的治疗中[3-4]。

女贞子系木犀科植物女贞（Ligustrum lucidum Ait）的干燥成熟果实。首见于《神农本草经》，具有滋补肝肾、明目乌发等功效。其味苦凉，归经属于肝、肾两经。女贞子作为补益药，经研究发现其化学成分对肝癌的治疗有显著的效果[5]。本研究拟通过网络药理学对女贞子的抗肝癌功效做整体探讨，为今后临床上使用女贞子提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 女贞子的有效成分收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中国知网、万方医学网、PubMed 对女贞子的化合物成分进行检索，其检索时限为2011 年1 月至2020 年8 月。通过口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.18或通过SwissTargetPrediction 网站的药代动力学及药物相似性对女贞子的化合物进行初步筛选。

1.2 药物作用靶点的预测

将女贞子收集得到的有效化合物利用TCMSP 中目标信息选项或者SwissTargetPrediction 数据库中的SwissTarget 预测选项对其有效成分进行靶点预测，并通过Uniprot 数据库将所的到的靶点蛋白转化为标准的基因名称。

1.3 构建化合物和预测靶点网络

利用Cytoscape 软件的构图功能，将筛选出来的化合物与预测靶点相结合，构建女贞子的成分与靶点网络图。

1.4 肝癌靶点基因的收集

利用GeneCards 和在线人类孟德尔遗传（online Mendelian inheritance in man，OMIM）数据库以“liver cancer”作为关键词进行检索，然后把得到的疾病靶点进行整合，从而得出肝癌的疾病基因。

1.5 药物和疾病的交集靶点

利用生物信息学与进化基因组学网站中的计算与绘制维恩图选项，对所得到的药物靶点基因和肝癌基因进行交集分析处理，并以维恩图的形式体现出来，最终得到两者的交集靶点基因。

1.6 构建蛋白间相互作用网络

将得出的交集靶点导入String 数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）分析，将搜索类型限定为“智人”，根据需要设置靶点间的要求和得分得出结果，并导出结果。随后，将其得到的PPI 网络导入Cytoscape 软件中，筛选关键靶点。

1.7 GO 分析及KEGG 通路富集分析

Metascape 是为实验生物学家提供全面的基因列表注释和分析资源的数据库[6]。使用该数据库对关键靶点进行GO 分析和KEGG 通路富集分析，设定物种限定为人并筛选出P ＜0.01的结果值。再将KEGG 分析得出的关键通路与靶点间的联系利用Cytoseape 软件进行可视化处理，绘制“靶点-关键通路”的网络图。

2 结果

2.1 女贞子有效成分的筛选

通过TCMSP、中国知网等数据库对女贞子有效成分进行筛选，得到有效成分共有16 种，删除无对应靶点的6 种成分，得到最终具有良好药效的有效成分有10 种。见表1。

表1 女贞子的有效成分

2.2 药物靶点预测及化合物-靶点网络的构建

利用SwissTargetPrediction 数据库对筛选出来的有效成分进行靶点的预测，选取对其评分值靠前的靶点，导入Uniprot 数据库，去除重复靶点，共得出预测靶点134 个。将化合物和预测靶点通过Excel 表格的整合，导入Cytoscape 软件中，得出化合物-靶点网络。见图1。

图1 化合物-靶点网络

2.3 肝癌靶点收集及维恩图的制作

通过GeneCards 和OMIM 数据库得到肝癌靶点1033 个，将其与药物预测靶点取交集，得到47 个共同靶点，即为有效靶点。见图2、表2。

图2 有效靶点的获取

表2 女贞子治疗肝癌的有效靶点

2.4 PPI 网络图的构建

将47 个有效靶点输入String 数据库得出PPI 网络图，见图3。其中网络里包含47 个节点和274 个边，平均节点度为11.7。将得到的PPI 网络导入Cytoscape软件中，根据节点的大小和边的粗细提取排名靠前的11 个靶点，颜色越深、节点越大表示靶点越关键，其中AKT1、ESR1、EGFR 等与其他蛋白联系较好。见图4。

图3 蛋白质-蛋白质相互作用网络图

图4 蛋白质-蛋白质相互作用中的关键靶点

2.5 GO 分析

GO 分析得出与疾病最相关的20 个条目，女贞子治疗肝癌的靶点主要涉及细胞对有机环状化合物的反应、对氧化应激的反应、对氮化合物的反应、对淀粉样β的反应、磷脂酰肌醇3-激酶信号转导、肽丝氨酸修饰等。见图5。

图5 有效靶点的GO 分析

2.6 KEGG 富集分析

KEGG 富集分析得出与疾病最相关的14 条通路，有效靶点涉及的通路主要为癌症的途径、前列腺癌、癌症中的转录失调、癌症中的MicroRNA、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路等主要通路。见图6。将结果利用Cytoseape 软件进行可视化处理，得到靶点-通路网络。见图7。

图6 有效靶点的KEGG 富集分析

图7 靶点-通路网络

3 讨论

肝癌在中医学的范畴属于“积聚”“臌胀”“黄疸”“胁痛”等疾病[7]。对于肝癌的病因病机，徐斌认为主要包括饮食不节、七情内郁、湿毒蕴结等，从而产生蕴毒、气滞、湿浊、痰凝、瘀血多种病理因素，不断积累导致肝癌发生[8]。随着中西医的兴起，中医药的研究也正处于新的时代。相关研究表明，女贞子的提取物对肝癌细胞具有明显的抑制作用[9]，临床观察也得出具有女贞子成分的中成药在联合化疗治疗肿瘤中也具有很好的治疗效果，如贞芪扶正分散片[10]。

肝癌的发生大多与体内正邪的变化有着密切的关系，扶正祛邪在肝癌的治疗中有着重大的意义。女贞子属于补益药中的补阴药，有古籍记载女贞子具有主补中、安五脏、养精神、除百疾的功效[11]。该药补益扶正的药性对肝癌的治疗有很大的作用。通过构建化合物-靶点网络结果显示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羟基酪醇等是该网络中的核心有效成分，与靶点联系较紧密。现代研究表明女贞子活性成分β-谷甾醇可通过线粒体途径将细胞周期阻滞在G2/M期，抑制肝癌HepG2 细胞生长，促进其凋亡[12]。而槲皮素在体外可抑制肝癌及其他多种肿瘤细胞的增殖与转移，诱导肿瘤细胞凋亡[13]。其主要机制包括调节细胞周期、降低氧化应激反应、抑制肿瘤组织血管内皮生长因子表达等，与抑制AKT 信号通路让其凋亡等有关[14]。山柰酚对肝癌Huh7 细胞生长有明显的抑制作用[15]。羟基酪醇也可以诱导多种肿瘤增殖抑制及凋亡发生[16]。综上结果所示，本研究中的化合物-靶点网络展现了女贞子多成分和多靶点共同作用治疗肝癌的特点。

通过搜集药物和疾病靶点，经过整合得出两者的共同靶点为47 个，经过PPI 网络构建分析得出AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶点在该网络中处于重要地位，可以作为女贞子治疗肝癌的关键靶点。研究表明AKT1 基因与肝癌的发生密切相关[17]，通过AKT1 还可明显抑制人肝母细胞瘤细胞的增殖和侵袭，并促进其凋亡[18]。在肝脏中雌激素只有与雌激素受体，尤其是ESR1 结合后才能发挥延缓肝细胞凋亡、改善肝纤维化、抑制肿瘤生长的生物学功能[19]。可见ESR1 可以作为诊断和治疗肝癌的重要靶点。研究发现EGFR 表达水平与肝癌细胞增殖和侵袭能力呈正相关，可作为良好的肝癌检测指标和治疗靶点[20]。SRC 也与肝癌密切相关，研究发现TRIM7 通过抑制SRC-mTORC1 信号轴的活化发挥对肝癌的抑癌效应[21]。由KEGG 通路富集分析得出这些靶点与肝癌、肝炎等通路联系密切，与上述目前重要靶点的研究结果及女贞子活性成分和靶点作用于肝癌的治疗大致相同。

通过GO 分析显示，女贞子主要通过细胞对有机环状化合物、氧化应激、氮化合物、淀粉样β的反应等生物进程发挥其治疗肝癌的作用。KEGG 通路富集分析得出，其主要富集在癌症的途径、前列腺癌、癌症中的转录失调、癌症中的MicroRNA、TNF 信号通路、NF-κB 信号通路等。其中癌症的途径、前列腺癌、癌症中的转录失调、癌症中的MicroRNA 均直接与癌症包括肝癌在内直接相关，表明女贞子有较好的抗肝癌效果。女贞子可以调控癌通路的表达，达到抑制肝癌细胞的效果。肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）是目前发现的抗癌作用较强的生物因子[22]，另外有研究证实女贞子提取物通过抑制TNF-α的表达来发挥其抗肿瘤作用[23]。这也与本研究所富集在该通路的结论可很好地吻合，提示该通路在本研究的重要性。杨金莲[24]初步证实了酒精通过引起ROS 水平升高，进而促进NF-κB 信号通路的活化，从而介导肝癌生长、转移及肿瘤血管的生成，此外NF-κB 信号转导通路的激活对H-ras12V 转基因雄鼠肝脏肿瘤的发生发展具有重要作用[25]。以上结果说明了女贞子活性成分的靶点分别作用于不同的通路，从而体现出其治疗肝癌的作用，但是具体的通路机制还有待进一步研究。

综上所述，本研究显示女贞子治疗肝癌的主要化学成分可能是槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、羟基酪醇等成分，这些有效成分可以通过AKT1、ESR1、EGFR、RTGS2、SRC 等靶点及对癌症的途径、癌症中的MicroRNA、TNF、NF-κB 等通路的调节，达到对肝癌有效的治疗作用。本研究通过筛选女贞子治疗肝癌的有效化学成分、有效靶点，以及其主要的生物进程和通路，为今后临床上中医中药治疗肝癌提供了新的方向和思路。