AP4 基因促进子宫内膜癌细胞增殖调节上皮间质转化相关分子表达的影响

陶淑芳，别延红（通讯作者），蔡 静，金琼燕，范 红

（上海市嘉定区安亭医院病理科 上海 201805）

激活增强子结合蛋白4（AP4）/转录因子结合蛋白4（TFAP4）是一种基本的螺旋-环-螺旋-亮氨酸-拉链转录因子，其最初被鉴定为与SV40 启动子结合的蛋白。后来，AP4 被表征为c-Myc 转录因子的靶标，c-Myc转录因子是在大多数肿瘤中被激活的原型致癌基因的产物[1-2]。研究发现，AP4 可能代表c-Myc 和N-Myc 下游的中央枢纽，介导它们的某些功能，例如增殖和上皮-间质转化（EMT）。AP4 表达升高与多种肿瘤类型的癌症进展和患者预后不良相关[3-4]。小鼠中AP4 的缺失表明AP4在控制特性，肿瘤起始和适应性免疫中的作用。子宫内膜癌是危害女性健康的一种重要肿瘤，且近年来发病率逐年增加。我们课题组前期进行了一些AP4 与子宫内膜癌关系的基础研究，如AP4 对子宫内膜癌细胞凋亡和恶性转化等的影响等[5]，然而，目前AP4 基因在子宫内膜癌中研究极少，其对子宫内膜癌细胞的上皮间质转化的调控作用也尚不清楚。在这里，我们将初步探讨AP4 基因对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对一些EMT 相关基因表达的调控。

1.资料与方法

1.1 一般资料

AP4 真核表达载体pez-M02-AP4 由广州复能基因构建，对照组质粒为pez-M02。子宫内膜癌细胞Ishikawa 购买自上海盖宁生物科技有限公司。细胞培养基DMEM 及Lipo3000转染试剂盒购自赛默飞世尔。AP4 抗体购自Sigma 公司。Trizol 试剂及PCR 试剂盒购自大连Takara 公司。增殖检测试剂盒来自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

基因转染：Lipo3000 脂质体试剂盒转染AP4 基因入子宫内膜癌细胞，分为对照组及AP4 组。参照Lipo3000 试剂盒说明书，DNA 与lipo3000 的比例是1μg ∶2μL。

RNA 及蛋白检测：基因转染48 h 后，分别收集细胞。Trizol 法提取RNA。RT-Real time PCR 法检测mRNA 水平改变，Western blot 电泳实验检测蛋白表达。其中AP4 基因的引物序列为：F：GAGGGCTCTGTAGCCTTGC，R：GAATCCCGCGTTGATGCTCT。E-钙黏蛋白的引物序列：F：CGAGAGCTACACGTTCACGG；R：GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG.Vimentin 的引物序列：F：GACGCCATCAACACCGAGTT；R：CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT。

细胞增殖测定：将基因转染后的细胞继续培养12 h，胰酶消化收取细胞并计数，然后铺于96 孔板，密度2.5×104/mL。在基因转染后24 h，48 h 及72 h 加入10 μL/孔CCK-8 试剂。继续孵育1 ～2 h，而后在全自动酶标仪上测定各孔吸光度值。设定的测定波长是450 nm，参比波长是630 nm，计算分析增殖数据。

2.结果

首先，我们利用lipo3000 脂质体转染pez-M02-AP4质粒入细胞。转染后48 h，提取RNA 和蛋白进行PCR 及蛋白电泳实验。结果表明，在转录水平，AP4 组mRNA 表达较对照组升高约3.756 倍（见图1）；在蛋白水平，AP4 组则检测到明确的蛋白表达（见图2），显示基因转染成功。

图1 AP4 基因转染上调AP4 的mPNA 表达

图2 AP4 基因转染上调AP4 的蛋白表达

我们进一步利用CCK-8 法测定了AP4 基因对细胞增殖的影响。细胞增殖实验的结果表明，AP4 组与对照组相比，在24 h，48 h，72 h，AP4组细胞增殖增加约17.95%（P＜0.05），26.45%（P＜0.05），21.38%（P＜0.05）（见图3）。

图3 AP4 基因促进癌细胞增值

在对EMT 相关分子表达的调控方面，AP4 组与对照组相比，E-cadherin的mRNA下调约40.80%（P＜0.01）（见图4），vimentin（丝蛋白）则上调约71.10%（P＜0.01）（见图5）。表明其具有潜在的促进子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的能力。

图4 AP4 基因下调的E-cadherin 的mPNA 表达

图5 AP4 基因上调vimentin 的mPNA 表达

3.讨论

最近的许多研究表明，AP4 在多种类型的肿瘤中高表达，包括乳腺癌，结肠直肠癌，胃癌，胰腺癌，前列腺癌，非小细胞肺癌和肝细胞癌等[1-2,6-9]。AP4 的表达是一个独立的预后指标，可根据转移情况预测总体生存时间和癌症进展。另外，AP4 对于维持癌细胞的细胞周期进程和调节肠内肿瘤的发生是必不可少的[1]，然而其在子宫内膜癌中的研究尚少。

上皮间质转化（EMT）最初是作为一种形态发生程序而发现的，它参与了多个组织和器官的形成以及伤口的愈合[4,10-12]。研究表明，上皮来源的肿瘤细胞经过EMT过程后，细胞黏附逐渐丧失以及细胞的迁移和侵袭特性增加。因此，肿瘤细胞的EMT 有助于转移，这是癌细胞的重要标志之一。经过上皮间质转化，静止的上皮细胞失去极性并与邻近组织分离，成为更具运动性和侵袭性的间充质样细胞。在癌症发展的后期阶段，EMT 发生在转移的初始阶段，其中肿瘤细胞从其主要部位扩散，生长并在身体其他部位形成肿瘤，最终导致患者死亡。另外，经过上皮间质转化过程的细胞具有与干细胞或者癌症干细胞相关的自我更新性状。已有研究发现，部分转录因子例如Snail，Slug，ZEB1，ZEB2 和Twist 等可以诱导上皮间质转化的发生[10-12]。这些因素直接抑制了细胞黏附介体E-cadherin，并且在一定程度上赋予了干细胞。

研究表明AP4 代表EMT-TF（诱导EMT 的转录因子），类似于Snail 或ZEB1/2[1]。AP4 与许多EMT 效应子和标记基因（如Snail，vimentin，FOS，LEF1 和N-cadherin）的启动子结合并上调[1]，并直接抑制CDH1/E-cadherin。此外，异位AP4 诱导的EMT 和AP4 对于c-Myc 诱导的EMT 是必需的。在异种移植小鼠模型中，AP4 的失活阻止了结直肠癌细胞系注射后肺转移的形成。此外，AP4 表达升高与患者生存不良和远处转移形成增加相关。使用转移性乳腺癌MDA-MB-231 细胞系，证明AP4 可以通过激活突变的p53-R280K 蛋白和缺乏DNA 结合域的显性阴性AP4 的表达来激活细胞迁移和侵袭，降低细胞的流动性。此外，大肠癌细胞中的AP4 抑制可抑制细胞迁移和侵袭，而AP4 的过表达则具有相反的作用[4]。子宫内膜癌是一种腺癌，起源于子宫腔内衬的上皮细胞。本次我们发现，AP4 也具有诱导子宫内膜癌细胞上皮间质转化的潜能。

综上所述，AP4 过表达于子宫内膜癌细胞后，抑制了E-cad 基因的表达，并且上调了vimentin 的表达，这一过程有助于降低细胞间黏附作用并促进细胞游离。