紫茎泽兰羟基泽兰酮在大鼠体内毒代动力学与组织分布*

李 超 吴 磊 张艳淑Δ

(1华北理工大学公共卫生学院，唐山 063210；2山东省职业卫生与职业病防治研究院，济南 250062)

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum spreng)系菊科泽兰属多年生半灌木草本植物，是我国首位的外来入侵植物，它侵占农田、果园、林地，与农作物争水、争肥、争阳光和空间。其可堵塞水渠，阻碍交通，危害畜牧业，对农业生产及环境生态的危害性极大。为了防控紫茎泽兰的传播蔓延，保护生态环境，人们对紫茎泽兰进行了开发利用[1-3]。紫茎泽兰羟基泽兰酮(Euptox A)是从紫茎泽兰中分离出的化合物，具有很好的杀虫及抑菌效果，可作为一类较好的生物农药资源进行开发利用[4-6]。但是，紫茎泽兰作为一种有毒杂草，牲畜食用后会导致肝、肾毒性[7]。因此，其对于人类健康的影响也不容忽视。为此，我们对Euptox A进行了系统的毒理学研究[8-10]。本实验通过研究大鼠静脉给予Euptox A的毒代动力学与组织分布，揭示Euptox A在动物体内的动态变化规律，为紫茎泽兰的安全利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

1100系列高效液相色谱仪，包括G1311A四元泵、G1379A在线脱氧机、G1316A柱温箱、G1315BDAD检测器和G1313A进样器，美国Agilent公司；AB204-A电子分析天平，梅特勒-托利多上海仪器公司；高速离心机，美国Thermo Fisher Scientific公司；Euptox A标准品室温下呈浅黄色固体，不溶于水，由中国农业科学院植物保护研究所提供，纯度99%。实验时用注射用大豆油为溶剂，配制后的Euptox A溶液经0.22 μm无菌滤膜过滤后备用。

1.2 动物分组、处理及样品采集

健康Wistar雄性大鼠33只，体质量240～260g，由山东大学实验动物中心提供，动物许可证号为：SCXK (鲁)2012-0001。饲养环境：室温20.0℃～23.0℃，相对湿度为45%～55%。实验动物房合格证号：SYXK(鲁)2011-0001号。

1.2.1毒代动力学研究 健康雄性Wistar大鼠15只，随机分为3组，每组5只，以尾静脉给药的方式，一次性静脉给予Euptox A 25、50和100mg·kg-1。各组分别于给药前和给药后5、10、15、20、30、45、60、90、120、180、270和360min于颈静脉窦处取血0.25mL，肝素抗凝，1000g离心10min，取血浆，-20℃冰箱保存备用。

1.2.2组织分布研究 健康雄性Wistar大鼠18只，随机分为3组，每组6只，以尾静脉给药的方式，一次性静脉给予Euptox A 50mg·kg-1。分别于静脉给药后10、60和120min处死大鼠，迅速取其心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠、睾丸和肌肉组织，用生理盐水将组织样品冲洗去除残留物，滤纸吸干，准确称量一定的质量，加入4倍生理盐水，制成20%的组织匀浆，1000g离心10min,取上清放置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 生物样品处理

取100μL血浆或组织样品加100μL乙腈混匀，8708g离心5min,取上清100μL加400μL流动相稀释混匀，经0.45μL滤膜过滤后进样20μL测定。取空白血浆及组织样品配成1、5、10、20、40、60、80、100mg·L-1的Euptox A标准系列溶液，经预处理后记录色谱图及峰面积，以Euptox A浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，计算出标准曲线方程。

1.4 Euptox A浓度测定

采用1100系列高效液相色谱仪测量生物样品中Euptox A浓度。色谱柱SB-C18 (250mm×4.6mm,5.0μm)，流动相为甲醇:水=60∶40(v/v)，流速为0.8mL·min-1，进样量20μL，检测波长为255nm，190～400nm波段全扫描。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 高效液相测定生物样品Euptox A含量的方法学确认

2.1.1Euptox A全血样品浓度测定方法确认 本实验前期已按照《化学药物非临床毒代动力学研究技术指导原则》完成Euptox A在大鼠全血中含量的方法学验证。大鼠全血空白杂质对检测无干扰，Euptox A在2～2000 μg·L-1范围内线性关系良好，Euptox A在20、200、2000 μg·L-1的精密度均<15%，日内和日间准确度在85%～115%之间，回收率为90.4%～109.1%，符合生物样品定量测定要求。

2.1.2Euptox A组织样品中浓度测定方法确认 Euptox A色谱图峰形良好，分离完全，心、肝、脾、肺、肾、脑、胃等各组织杂质对检测无干扰，样品于室温放置12h及-20℃放置1周稳定，精密度均<15%，准确度在85%～115%之间，回收率为93.8%～104.7%。结果表明本实验方法符合生物样品分析指导原则的要求，具有较高的专属性。以Euptox A浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，得标准曲线方程。见表1。

表1 大鼠组织中紫茎泽兰羟基泽兰酮(Euptox A)的校正标准曲线和相关系数

2.2 Euptox A在大鼠体内的毒代动力学

大鼠静脉给予Euptox A后，Euptox A的毒代动力学符合线性毒代动力学特点。大鼠单次静脉给予Euptox A 25、50和100 mg·kg-1后，5min血药浓度达到最高值分别为(2.57±0.60)、(5.83±0.94)和(10.72±2.08)mg·L-1，60min血药浓度已降至峰浓度的1/10～1/5；消除半衰期分别为(27.4±6.7)、(21.6±5.4)和(18.3±5.8)min；AUC分别为(2039.4±835.3)、(4277.2±1194.6)和(7842.7±1077.8)mg·min-1·L-1；清除率无明显差异，表明在给药范围内无消除饱和现象。见图1、表2。

图1 大鼠静脉给予Euptox A后的血药浓度-时间曲线

表2 大鼠静脉给予Euptox A的主要毒代动力学参数

2.3 Euptox A在大鼠组织中的分布

大鼠静脉给予Euptox A 50mg·kg-1后，在血液、心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、睾丸和肌肉组织中均有分布，以血液、肝和心较高，给药后10min达到最高值，60min后显著下降， Euptox A在大鼠各组织分布后，消除也较快，给药后120min各组织中的含量仅为给药后10min的1/15～1/7，说明Euptox A不会在组织中蓄积。见表3。

表3 大鼠静脉给予Euptox A 50mg·kg-1各组织中的分布

3 讨论

紫茎泽兰作为具有毒性的一类外来入侵植物，大面积及高密度是其入侵过程中最为显著的特征。随着其研究深入，发现紫茎泽兰叶片提取物Euptox A在抑菌及杀虫中具有较好的作用。但是，其可导致动物肝脏损伤[11]。目前，还未见对Euptox A相关毒代动力学及组织分布的研究。

本文结果显示，Euptox A最大血药浓度与给药剂量呈良好的线性关系，平均消除半衰期最长约30 min，清除率为0.24～0.39 L·min-1·kg-1。提示，在本研究剂量范围内，Euptox A在体内代谢转化较快，具有吸收快及清除快的特点。在大鼠静脉给予Euptox A 50 mg·kg-1后，Euptox A在所测定的各组织中均有分布，给药10 min后各组织中的含量达最高，然后逐渐下降，120 min后大部分组织含量降至较低。Euptox A在大鼠脑和睾丸中均可测出，说明Euptox A通过血脑屏障和血睾屏障，可能与其相对分子量较小有关。有研究发现，紫茎泽兰草粉对小鼠睾丸精母细胞染色体畸变率未见明显影响，这可能由于紫茎泽兰相关提取物在睾丸中浓度较低，且消除较快，以上特征与本研究中Euptox A相似。Euptox A在血浆中含量较高，谢鹏等[12]研究发现，Euptox A可诱发小鼠血液感染性损伤。同时我们发现心脏和肝脏中Euptox A含量较高，这可能由于该组织器官血流丰富。叶妍琳等[13]发现，紫茎泽兰中毒马匹的谷丙转氨酶、谷草转苷酶、碱性磷酸水平显著升高，而肌酐水平下降，紫茎泽兰中毒会对马的肝脏以及肾脏功能产生损伤；董强等[14]同样发现，紫茎泽兰全草对小鼠肝脏、肾脏有中等毒性，但以上研究均未证实紫茎泽兰中何种物质可造成肝脏损伤。基于以上研究，我们课题组进一步通过亚慢性毒性实验发现，Euptox A对小鼠肝脏有较强的毒性作用。

通过研究Euptox A在大鼠体内的毒代动力学和组织分布特征，揭示其代谢规律及分布特征，为Euptox A的进一步开发利用提供毒性评价相关的科学依据。

利益冲突：所有作者均申明不存在利益冲突。