秋葵籽多糖提取工艺优化

李宁洁，郭佳敏，赵云蛟，刘 锐,*，张 民，吴 涛，隋文杰

（1.天津科技大学，省部共建食品营养与安全国家重点实验室，天津 300457；2.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；3.天津农学院，天津 300384）

秋葵（Abelmoschus esculentusL.Moench）也称为黄秋葵、咖啡黄葵，属于锦葵科草本植物，富含蛋白质、油脂、生物碱、多酚类化合物及微量元素，素有“蔬菜之王”的美誉[1]，具有降血糖、降血脂、抗氧化、减轻抑郁、抗菌、抗癌等多种生理功能[2-6]。

秋葵主要以嫩果荚入菜，对其种子的食用价值尚未开展深入的研究。秋葵籽富含脂肪、蛋白质、多糖、多酚和黄酮等营养素，其主要成分的开发与利用逐渐引起重视[7]。田科魏[8]优化确定了超临界二氧化碳法是提取黄秋葵籽中油脂的最佳工艺，也是高品质秋葵籽油生产的首选工艺；李加兴等[9]采用碱提酸沉法提取秋葵籽中蛋白质，结果发现，在最优工艺条件下提取率可达72.3%。然而，目前秋葵籽的加工利用还集中在其油脂的提取、精炼及蛋白质的提取工艺等方面，对秋葵籽多糖的提取及研究的报道较少。

多糖的提取方法有热水提取、超声波辅助提取[10]、微波辅助提取[11]和酶辅助提取[12]等。虽然微波辅助提取的多糖比热水浸提的多糖表现出更高的抗氧化活性，但在提取的过程中可能导致多糖降解[13]；酶或超声波处理同样可能引起多糖降解，影响多糖的生物活性[14]。热水浸提法是提取多糖的常用方法，具有经济、设备简单、易于操作等优点。综合考虑，本文以秋葵籽为原料，通过单因素和响应面实验优化了秋葵籽多糖的热水浸提工艺参数，以期得到一种高效、经济的提取方法，为秋葵籽资源的实际开发利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

秋葵籽，购自于安徽省毫州市中药材国强药业。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、石油醚、三氯甲烷、正丁醇、酒石酸钾钠、无水亚硫酸钠、氢氧化钠等，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

K9840 全自动凯氏定氮仪，山东海能科学仪器有限公司；SQP 分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；旋转蒸发器，RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；水浴磁力搅拌器，XMTD-204，天津市欧诺仪器仪表有限公司；高效液相色谱仪，LC-20AT，日本岛津公司；电热恒温鼓风干燥箱，DH-101，天津市中环实验室电炉有限公司；紫外可见分光光度计，TU-1810PC，北京谱析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 秋葵籽多糖提取工艺单因素实验

秋葵籽经清洗、干燥后，使用粉碎机粉碎至60 目。通过索式抽提器对其进行脱脂处理6 h，自然干燥得脱脂秋葵籽粉。通过单因素实验分别考察提取温度、料液比、提取时间和提取次数对秋葵籽多糖提取得率的影响。

（1）提取温度对多糖提取得率的影响

提取温度分别设置为40、50、60、70、80 ℃，按料液比1∶8（g/mL）加入蒸馏水，提取时间为2 h，反复提取3次，3 500 r/min 离心5 min，合并上清液，50 ℃旋蒸浓缩至原体积的四分之一，测定样品中的总糖含量，研究提取温度对多糖提取得率的影响。

（2）料液比对多糖提取得率的影响

提取温度设定为60 ℃，料液比分别选择1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12（g/mL），其他同（1）。

（3）提取时间对多糖提取得率的影响

提取温度设定为60 ℃，料液比1∶6（g/mL），提取时间分别选择为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，其他同（1）。

（4）提取次数对多糖提取得率的影响

提取温度设定为60 ℃，料液比1∶6（g/mL），提取次数分别选择1、2、3、4、5 次，其他同（1）。

1.3.2 Box-Benhnken 实验

在单因素实验结果的基础上，根据Box-Benhnken 中心组合设计原理，采用三因素三水平响应面分析法，研究提取时间、提取温度、料液比对多糖提取得率的影响，优化秋葵籽多糖的最佳提取工艺。Box-Benhnken 实验设计如表1 所示。

表1 Box-Benhnken 实验因素和水平表Table 1 The factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.4 测定指标与方法

水分含量参照GB 5009.3—2016 国标法测定[15]；蛋白质含量参照GB 5009.5—2016 国标法测定[16]；脂肪含量参照GB5009.6—2016 国标法测定[17]；灰分含量参照GB5009.4—2016 国标法测定[18]；淀粉含量参照GB 5009.9—2016 国标法测定[19]；膳食纤维含量参照GB 5009.88—2014 国标法[20]和megazyme assay kit K-RINTDF 10/15 方法测定。所有数据均做3 次平行。

采用苯酚硫酸法测定多糖含量[21]。配制葡萄糖标准溶液浓度为10、20、40、60、80、100 mg/L，分别吸取1 mL 于20 mL 具塞试管中，再加入6%苯酚溶液1.0 mL，再迅速加入5.0 mL 浓硫酸，室温下放置10 min，漩涡振荡充分混匀，再置于30 ℃水浴锅中反应20 min，于490 nm 处测其吸光度。秋葵籽多糖提取得率计算公式如式（1）所示。

式中，y为秋葵籽多糖提取得率，%；C为溶液中秋葵籽多糖的浓度，mg/mL；V为秋葵籽多糖溶液体积，mL；N为多糖溶液稀释倍数；m为秋葵籽质量，g。

1.5 数据处理

响应面实验采用Design-Expert 10 软件进行设计；实验数据利用SPSS 19.0 软件进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 秋葵籽基本成分

秋葵籽的基本成分如表2 所示。秋葵籽中膳食纤维、蛋白质和脂肪含量占主要部分，蛋白质含量为38.00%，脂肪含量为14.14%，膳食纤维含量为37.67%，其中可溶性膳食纤维含量为5.10%，不溶性膳食纤维含量为32.56%，这与文献报道的基本一致[22]。

表2 秋葵籽基本成分Table 2 Proximal composition of okra seed flour

2.2 秋葵籽多糖最佳提取工艺的确定

2.2.1 单因素实验

（1）提取温度对多糖提取得率的影响

温度对秋葵籽多糖提取得率的影响见图1。由图可知，随着温度的升高，多糖提取得率先升高后下降。温度低于60 ℃时，有利于秋葵籽多糖充分溶解，多糖提取得率逐渐增大；温度60 ℃时，多糖提取得率最大，为6.11%。当提取温度高于60 ℃时，多糖提取得率开始下降，可能是由于较高的温度破坏了多糖结构[23]。因此，综合考虑尽可能保留多糖的结构与活性，选用40、50、60 ℃进行后续的响应面实验。

图1 提取温度对多糖提取得率的影响Fig.1 Effects of extraction temperature on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（2）料液比对多糖提取得率的影响

料液比对秋葵籽多糖提取得率的影响见图2。由图可知，多糖提取得率随着料液比的升高呈现先升高后下降的趋势。当料液比为1∶4 时，多糖无法充分溶于水中，导致提取得率低；当料液比为1∶6 和1∶8 时，多糖得率显著提高，分别为5.04%和5.00%，两者差异不显著；当料液比为1∶10 和1∶12 时，提取得率下降趋势明显，且造成资源的浪费，所以料液比为1∶8 较合适。综合考虑，选用1∶6、1∶8、1∶10 三个因素进行响应面实验。

图2 料液比对多糖提取得率的影响Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（3）提取时间对多糖提取得率的影响

提取时间对多糖提取得率的影响见图3。由图可知，多糖提取得率随着提取时间的增加而逐渐增加，当提取时间为1.5～2.5 h 时，多糖基本全部溶出，曲线趋于平缓。故提取2.0 h 较适宜。综合考虑，选用1.0、2.0、3.0 h 三个水平进行响应面实验。

图3 提取时间对多糖提取得率的影响Fig.3 Effects of extraction time on the extraction yield of okra seed polysaccharides

（4）提取次数对多糖提取得率的影响

提取次数对多糖提取得率的影响见图4。由图可知，多糖得率随提取次数的增加而逐渐增加。提取3 次后多糖基本完全溶出，继续增加提取次数，多糖提取得率无显著性增加。因此，提取次数选为3 次。

图4 提取次数对多糖提取得率的影响Fig.4 Effects of extraction number on the extraction yield of okra seed polysaccharides

2.2.2 Box-Behnken 实验

由表3 和表4（见下页）可知，模型显著（P＜0.01），失拟项不显著（P≥0.05），说明模型建立成功，可用该模型对真实情况进行预测。响应值的变异系数CV为2.99%，说明该实验操作可信度高。提取时间对多糖提取得率影响不显著（P≥0.05），提取温度对多糖提取得率影响显著（P＜0.05），料液比对多糖提取得率影响极显著（P＜0.01）；得到回归方程如下所示：

表4 多糖提取响应面优化的方差分析Table 4 Variance analysis of response surface optimization for extraction of okra seed polysaccharides

表3 响应面法优化提取秋葵籽多糖的实验设计与结果Table 3 Response surface methodology for optimizing extraction of okra seed polysaccharides

各个因素之间对多糖提取得率的曲线图和等高线图如图5、6、7（见下页）所示。

图5 提取温度和时间对多糖提取得率影响的曲面图和3D 图Fig.5 Response surface plots and 3D charts of the effects of temperature and time on polysaccharide extraction

图6 提取时间和料液比对多糖提取得率影响的曲面图和3D 图Fig.6 Response surface plots and 3D charts of the effecs of extraction time and material-liquid ratio on polysaccharide extraction

图7 提取温度和料液比对多糖提取得率影响的曲面图和3D 图Fig.7 Response surface plots and 3D charts of the effecs of extraction temperature and material-liquid ratio on polysaccharide extraction

通过回归分析，得到秋葵籽多糖理论最佳提取工艺条件为提取时间为2.32 h，提取温度51.63 ℃，料液比为1∶10（g/mL），多糖提取得率最高为6.30%。考虑实际操作的便利，修正秋葵籽多糖的最佳提取条件为提取时间2.3 h，提取温度52 ℃，料液比1∶10（g/mL），进行验证实验，得出多糖提取得率为6.25%，与模型预测值接近。

3 结论

本研究根据单因素实验对提取温度、提取时间、提取次数以及料液比分析，应用响应面实验优化确定秋葵籽多糖的最佳提取工艺为提取时间2.3 h，提取温度52 ℃，料液比1∶10（g/mL）。在此条件下，秋葵籽多糖得率为6.25%，与模型预测值接近。该研究可为秋葵籽精深加工提供参考依据。