食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展

黄金发，戴 煌，黄周梅，马 辉，王加华，肖安红，舒在习

（1.山东新希望六和集团有限公司，山东青岛 266100；2.武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023；3.杭州老爸评测科技有限公司，浙江杭州 310051）

近年来随着经济的发展，人们生活水平不断提高，对食品品质的要求也越来越高，其中符合食品安全要求是保证食品品质的首要前提。水果在生长、采收、贮藏、运输、销售等过程中，易受到病原微生物的污染，特别是在贮藏期间，由病原菌侵染引起的水果采后腐烂较多，产生并积累各种真菌毒素。其中，污染水果最主要的真菌毒素包括链格孢霉毒素、展青霉素、赭曲霉毒素及黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）。长期以来，由于鲜食水果在食用过程中会去除腐烂部位，水果中的真菌毒素污染未引起足够的重视。研究表明，腐烂部位周围的健康组织也会有不同程度的真菌毒素检出[1]。通过剔除腐烂部分降低毒素及病菌污染，这并不能完全消除水果制品的潜在风险。黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等在合适的温度和湿度条件下产生的次级代谢产物，对人畜有强烈的致病性、致癌性，严重危害人体健康，在粮油、饲料以及副产品中广泛存在[2]。污染粮食的黄曲霉毒素主要有B1、B2、G1和G2，黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最强[3]，被世界卫生组织（WHO）列为Ⅰ类致癌物。AFB1性质稳定，对光和热比较稳定，在280 ℃高温时才会发生降解，因此，一般烹调加工温度难以破坏AFB1结构。近几年，我国由AFT 引发的食品安全问题不断发生[2]。我国于2017 年3 月17 日颁布了新修订的真菌毒素限量标准GB 2761—2017《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》[4]，目前已成为各级政府、质监机构监管食品中真菌毒素污染的标准依据。

为了保障食品安全、维护消费者权益，准确检测食品中AFT 含量，确定AFT 污染程度至关重要。我国《GB 5009.22—2016 食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素B族和G 族的测定》规定的测定方法主要有薄层色谱法、液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附筛查法[5]。随着检测技术的快速发展，越来越多的AFT 新型检测方法被开发。近年来食品安全事件屡见不鲜，消费者对食品安全越来越关注，市场对快速检测技术的需求也越来越高。2017 年国家食品药品监管总局组织制定了《食品快速检测方法评价技术规范》，为开发AFT 快速检测方法提供了标准和依据。本文针对国内外AFT 的检测技术进行简要总结，尤其是近年来发展的新型快速检测技术和方法，对比分析各种方法的优缺点，以期为AFT快速检测新技术的开发和应用提供理论支持。

1 色谱法

色谱法是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。

色谱法分为薄层色谱法和液相色谱法。薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是应用最早的AFT 检测技术之一，适用于具有荧光性质的毒素检测[6]。其基本原理是在365 nm 波长的紫外光照射下，AFB1、AFB2产生紫色荧光，AFG1、AFG2产生绿色荧光，通过对比样品与标准品的荧光强度来确定其含量[7]。TLC 法具有所需设备简单、操作方便、检测成本低等优点，缺点在于样品前处理复杂、易受周围环境影响、结果准确性差，且该方法的最低检出限远高于国际规定的毒性安全限量[8]，故此方法使用较少。液相色谱（liquid chromatography，LC）检测方法是目前最常用的检测AFT 的方法之一。其原理是样品经提取、净化、去除干扰物质后经过色谱柱，分离组分在色谱柱的流动相和固定相中的溶解度不同而将样品中的AFT 分离，然后进入检测器进行分析和鉴定。LC 法具有准确度高、重现性好等优点，但缺点在于样品前处理复杂、操作繁琐、成本较高、不利于大批量样品检测，且由于AFB1和AFG1接触水以后，会发生荧光猝灭现象，很难用普通LC 法直接检测出来。常见的LC 检测方法有液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography-mass spectromety，LC-MS）、高效液相色谱-质谱法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）和超高效液相色谱法（ultra high performance liquid chromatography，UHPLC）。MS 作为一种高通量、高灵敏度的检测器，无需衍生化反应，能简化样品的前处理步骤。MS 的多反应检测模式能同时对多种毒素进行检测，提高了检测效率。然而MS 设备昂贵，导致难以普及使用。目前许多新材料被研究用于样品前处理，例如结合Fe3O4磁性纳米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）[9]和分子印迹技术[10]作为吸附剂萃取食品中AFT，能提高富集效率，简化样品前处理步骤，大幅提升HPLC-MS 的检测性能。随着液相色谱系统颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高，填料粒径＜2 μm 的UPLC 柱效更高，分离效果更好，灵敏度更高，适于微量分析[11]。HPLC/UHPLC 法具有灵敏度高、准确、可靠的优点，是国标使用的方法，但是需要较昂贵的仪器及专业操作，且样品前处理复杂，难以进行大规模的样品检测。

2 免疫法

免疫分析法是利用抗原和抗体间的特异性结合反应、来检测待测物质（如药物、毒素、蛋白质、微生物等）的一种分析方法。由于抗原的抗原决定簇和抗体的抗原结合部位间具有结构互补性及良好的亲和力，可以发生相互作用，因此，抗原和抗体之间具有较高的特异性和选择性。在抗原-抗体结合过程中，一般通过已知抗原检测未知的抗体，或通过已知抗体检测未知的抗原，然后选择定性或定量的方法进行测定。目前，免疫分析技术已广泛应用于临床诊断和医学研究中，成为一种常见的生化分析手段。标记免疫技术是在抗原-抗体反应基础上标记抗体或抗原的免疫检测技术，一般将酶、荧光素、放射性核素等作为标记物进行标记。标记物可以保持抗原或抗体本身的活性，而不改变其免疫特性。当标记物连接到相应抗原或抗体后，可通过直接测定复合物中的标记分子及相应反应，实现目标物质的定量分析。按标记物可以分为酶联免疫吸附法、侧流免疫层析法、荧光法、放射免疫测定法、化学发光免疫分析法等。

2.1 酶联免疫吸附法

酶联免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是基于免疫学和细胞工程学的检测技术，是检测食品中AFB1最简单、方便的方法之一。ELISA 一般吸附在96 孔或394 孔板表面进行，常采用竞争法构建ELISA检测AFT。利用抗原与抗体之间的高度特异性和酶的高效催化性，将抗原或抗体与载体蛋白结合固定在基板表面，加入酶标抗原/抗体与样品中的抗原和载体上的抗原或抗体发生反应，产生酶-抗原-抗体的复合物，通过添加酶的反应底物使溶液快速产生颜色变化，从而进行定性定量分析的方法，又称比色法[12]。常用底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺和2,2’-氨基-二（3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6）铵盐[13]。有研究利用酸碱指示剂作为显色底物，在不同pH 下的颜色变化来开发简易的比色法[14]。相比于仪器检测方法，ELISA 在灵敏度、成本、操作技术等方面具有优势。目前，市场上已有许多商业化的ELISA 试剂盒[15]，其准确性、检测范围等方面都已较为成熟，可为现场快速检测提供支持，特别是对满足发展中国家和不发达国家的食品安全检测需求具有重要意义。然而，ELISA 方法存在线性范围窄，试剂保质期短，酶活性不稳定，需要低温保存，在实际检测样品中易出现假阳性结果等缺点[16]。

基于酶联免疫技术的比色法是通过酶催化显色底物产生颜色变化，检测相应信号的分析方法，具有快速、简便的优点，结果可用肉眼直接观察。类似的利用适配体作为识别原件，结合纳米材料的比色法也是常用的检测方法之一，其原理是纳米颗粒（纳米金、纳米银等）具有非常高的消光系数和强吸附性，在分散状态下呈红色，溶液环境改变使得纳米颗粒聚集后变为蓝色，根据分散和团聚状态下的不同颜色从而间接地实现目标物定性和定量测定[17]。基于纳米颗粒开发的比色方法可直接通过肉眼观察颜色变化定性判别，也可利用紫外-可见光谱检测吸光度定量分析AFB1含量[18]。基于适配体的纳米颗粒比色法可提供稳定的、视觉上可观察到的实验结果，操作简单快捷，适于现场快速检测。

2.2 侧流免疫层析法

侧流免疫层析法（lateral flow immunoassay strips，LFIAs）是集单克隆抗体技术、免疫技术和新材料技术于一体的检测方法，其原理是在免疫层析纸上固定半抗原作为检测线，间隔一段距离固定免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）作为对照线。在样品中加入标记物-抗体复合物，若样品中不含待测抗原，标记物-抗体将与检测线上半抗原特异性结合形成颜色带，同时标记物-抗体与对照线上的IgG 结合也形成颜色带，显示两条颜色带，结果呈阴性；若样品中含有待测抗原，则游离抗原与标记物-抗体结合，竞争性抑制检测线上的半抗原与标记物-抗体的结合，导致检测线的条带颜色变浅，甚至消失，检测结果呈阳性，样品中待测抗原的含量与测试线条带颜色的深浅成反比[19]。信号标记物一般都具有合成简单、信号强等优点，常用的标记物有纳米金（gold nanoparticle，AuNPs）[20]、碳纳米材料[21]、量子点[22]、MNPs[23]等。其中，基于AuNPs 的LFIAs 具有迅速、便捷、安全、可现场化检测等优势，被开发成各类目标物的免疫试纸条很快进行商业化应用[24]，而且可同时实现多目标检测[25]，现已广泛用于AFT 检测[26]。基于膜的LFIAs 具有简单、快速（可在10 min 内检测）、成本低的优点，被广泛用于食品安全检测领域。然而LFIAs 只能用于初步筛选，仅提供定性或半定量结果，而没有定量信息。利用条纹阅读器将试纸条上的颜色密度转换成测试线或控制线的光密度可以准确测量信号强度。

2.3 荧光法

荧光法是将具有荧光的物质制成荧光标记物作为探针来检测目标物，具有特异性强、灵敏度高、分析速度快、使用时间长等优点。荧光法有效克服了比色法灵敏度相对较低的缺点，通常与免疫层析法结合使用。常用的荧光标记物包括量子点[27]、荧光微球[28]、荧光有机染料[29]等。荧光法主要包括荧光标记法[30]和荧光共振能量转移法（fluorescence resonance energy transfer，FRET）[31]。荧光标记法采用荧光标记物代替酶来产生荧光信号，原理与ELISA 类似。Tang 等[32]把AFB1-BSA 耦合物修饰在Fe3O4MNPs 表面作为探针，将荧光染料罗丹明B（rhodamine B，RB）包埋在介孔SiO2纳米粒子内，在其表面修饰抗体作为荧光探针，利用直接竞争模式构建荧光法检测AFB1。加入含AFB1样品时，AFB1和AFB1-BSA-MNPs 与抗体-SiO2-RB 竞争性结合，磁分离后检测剩余溶液的荧光信号，荧光强度与AFB1含量呈负相关。该方法在花生油样品中检测结果与HPLC 结果一致。供体荧光基团的发射光谱与受体荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当用供体基团的激发波长激发时，可观察到受体基团发射荧光的现象称为荧光共振能量转移。通过测量分别标记有供体/受体荧光团的荧光可建立荧光检测法[33]。供体为荧光标记物，受体一般为较强荧光猝灭的材料，如氧化石墨烯（graphene oxide，GO）[34]、AuNPs[33]、MNPs[35]等纳米材料。荧光法具有较高的灵敏度，在AFT 检测中显示出巨大的潜力。然而，在荧光检测过程中，生物系统中的核酸、氨基酸和蛋白质分子容易被激发出强烈的背景荧光，增加背景干扰而影响检测灵敏度，需要除去食品基质，降低基质产生的背景干扰。

3 光谱法

光谱分析技术是指获取来自目标特定波长范围内的光谱信息进行变换分析，提取相关物理参数信息。该目标所产生的光谱信息可以来自目标自身的自发辐射，或者光谱信息来自测试目标对来自辐射源的反射辖射。光谱的波长位置信息包含了辖射光源和传播介质的化学元素构成，谱线强度则反映了目标的元素含量大小、压力、形状等信息。目前用于AFT 检测的光谱法主要有表面增强拉曼散射光谱法和近红外光谱法。

3.1 表面增强拉曼散射技术

表面增强拉曼散射（surface enhanced raman scattering，SERS）光谱具有强特异性、高分辨率、高灵敏度等独特优势，其原理是吸附贵金属（如金、银或铜）粗糙表面的样品用拉曼光谱法测定时，拉曼光谱信号受表面等离子共振而得到增强。SERS 是观察和检测目标分子的有效方法。通过高度增强的拉曼信号，可以识别非常低的分子浓度并改善传感器应用中的检测极限。利用SERS 检测AFB1、AFB2、AFG1、AFG2时，发现四种AFT 的特征拉曼峰为1 592 cm-1，拉曼信号强度与AFT 含量呈良好的线性关系，结果与密度泛函理论计算一致[36]。基于免疫法的SERS 传感器，在一块芯片上可实现三种真菌毒素的独立检测[37]。拉曼光谱检测快速、简单，但是极少数贵金属粗糙面才具有较强的SERS 效应，其制作工艺难以统一标准化，导致其重复性较差，应用受到限制。

3.2 近红外光谱技术

近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）是一种快速、无损且经济的评估产品质量的分析工具[38]，在农业、食品和制药等产业中用于原料测试、产品质量控制和过程监控[39]。Putthang 等[40]利用短波NIRS 检测抛光大米中的AFB1残留，建立偏最小二乘判别分类模型的相关系数（r）为0.952，对含有AFB1的样品分类正确率达到90%，表明NIRS 技术能用于筛选被AFB1污染的抛光大米。Tao 等[41]利用可见-近红外光谱法在400～2 500 nm下检测去壳花生表面的AFB1，采用随机森林算法筛选最适特征波长，建立的PLS-DA 模型在20 μg/kg 和100 μg/kg 阈值下的整体分类判别正确率分别为90.00%和94.29%。相比于其他方法，NIRS 法灵敏度不高，但分析简便快速、不会破坏待分析样品，可用于AFT 的快速筛查和在线检测。

目前在特定波长下的成像技术也应用于AFT 的检测。如Wang 等[42]利用NIRS 成像技术检测玉米中AFB1，选择1 739 nm 和2 344 nm 波长作为输入，经过主成分分析后建立模型，像素验证准确率达到100%，利用独立数据验证方法重复性，准确率为92.3%。高光谱成像（hyperspectral imaging，HSI）是一项新兴技术，将成像和光谱学集成到样品的空间和光谱特性的系统中。HSI 为图像中的每个像素获得完整的光谱，能在样本内的多个位置识别独特的光谱特征[43]。成像技术灵敏度不高，但能简便快速检测食品表面AFT 污染情况，有较强的应用潜力。

4 生物传感器方法

生物传感器是一种以生物敏感材料为识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、细胞、组织、核酸等生物活性物质）结合适当的理化换能器及信号放大装置的分析工具或系统。基本原理为当目标物与识别元件特异性结合后，可通过信号转换器将检测信号转变为电信号，经过仪表放大和输出从而达到检测目标物的目的。目前在AFT 检测中使用较多的有电化学生物传感器、石英晶体微天平传感器、表面等离子共振传感器等。

4.1 电化学法

电化学法（electrochemistry，EC）是基于电化学原理在化学反应和电流反应之间建立关系，将生物活性材料或化学复合物附着到电极表面，AFT 被固定在电极表面上的材料捕获，引起电极表面电活性分析物的化学反应而发生变化，测量形成的电化学信号，如电位、电流、电导率或电量的物理量。常采用三电极系统，包含工作电极、对电极和参比电极[44]。为了提高检测性能，可在工作电极表面修饰一些功能材料，如GO[45]、AuNPs[46]、单壁碳纳米管[47]、多壁碳纳米管[48]、MNPs[49]等。这些功能材料的修饰，提升了工作电极的电子传导效率，同时能提高抗体或适配体的负载量，进而提高检测灵敏度[50]。电化学法以其灵敏度高、检测迅速、设备操作简单、成本低、不受样品颜色和浊度的影响等优势在AFT 的快速检测中脱颖而出。目前常用的电化学方法有电流法（例如电流-时间曲线）、伏安法（例如差分脉冲伏安法、循环伏安法）和阻抗法。设计新颖的纳米材料作为制造电极的基底是获取高性能生物传感器的理想方法。许多先进的纳米复合材料具有高电导率，与受体的强结合相互作用，例如，ZnS 量子点、核-壳结构和金属有机框架材料被设计用于制造具有高灵敏度、选择性和稳定性的电化学生物传感器[51]。同时为了提高电流信号强度，通常将酶标记在AFB1 抗体/适配体上进行信号放大。电化学法在成本低、简便性、便携性、快速响应、灵敏度高、特异性强、易实现自动化等方面有优势，已被广泛研究。随着材料和加工技术的发展，可抛弃、便携式商业化电极，如丝网印刷电极[52]、叉指微电极[53]等已经逐步显现实际应用潜力，降低了检测成本。然而电化学法环境适应性差，食品基质容易对背景信号产生干扰，需要根据不同的环境来调整方法并优化。为了验证电化学法的可靠性，应对开发电化学法与金标法进行更多的比较研究，充分探索电化学法的性能、使用范围和条件。

4.2 石英晶体微天平生物传感器法

石英晶体微天平生物传感器法（quartz crystal microbalance，QCM）的基本原理是将表面修饰有识别元件的压电传感器放置在含有分析物的溶液中时，目标物与固定在涂层表面的识别元件相互作用会导致晶体质量增加，并引起QCM的震荡频率偏移，从而进行检测[54]。QCM传感技术可实现AFB1 的无标记和实时检测。目前应用QCM的新策略主要包括：（1）构建新的识别元件来捕获更多的目标物将信号增大。例如开发分子印迹层、共价有机骨架复合材料等[55]作为识别原件，来捕获更多的AFT，使得界面质量增大来增强检测信号。利用基因技术开发灵敏度更高的抗体IgA，由于IgA 的分子量比IgG 大，其敏感性更高[56]。（2）开发新型信号放大材料，如Fe3O4@SiO2核-壳磁性复合纳米粒子，在外加磁铁的作用下将复合磁性纳米粒子固定在QCM电极表面，实现信号放大。

目前QCM 的设计和开发通常在实验阶段比较成熟，但在实际应用方面有明显局限性。实际样品中食品基质引起的噪声会导致低浓度的AFB1信号难以检测，QCM界面的非特异性吸附导致实验结果与QCM的真实物理现象之间的误差较大。QCM具有简单、快速、成本低和免标记的优点，但在实际应用方面有明显的局限性。

4.3 表面等离子共振生物传感器法

表面等离子共振生物传感器法的基本原理是当入射光以一定的入射角照射到金属表面（通常是金表面）时，一部分光能穿过金属涂层与金属表面层中的电子耦合，电子由于激发在平行于金属表面方向上移动，发生表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）[57]。目前常用的是基于适配体和抗体的SPR 传感器来检测AFB1。适配体具有价格便宜、易获得、稳定性好等优点，当AFB1与基于适配体的SPR 传感器的芯片结合时，SPR 信号增加。传感器芯片可通过流注缓冲剂将绑定的AFB1从适体上解离实现再生。该方法的芯片灵敏度高、稳定、易于再生，克服了基于抗体和竞争性SPR 分析的限制[58]。SPR还可以对多种霉菌毒素进行同时检测，例如利用直接竞争法构建SPR 传感方法，同时检测大麦中六种真菌毒素，该芯片可以重复使用60 次，对6 种霉菌毒素的交叉反应低，与LC-MS/MS 验证结果具有很好的一致性[59]。

SPR 生物传感器对AFs 的检测具有实时、免标记、试剂消耗少等优势，然而SPR 法存在设备体积大、价格昂贵等问题，限制了其实际应用。

综上所述，本文所综述方法的优缺点见表1。从表1中可以看出，不同的检测方法各有优劣。仪器分析法灵敏度高，能够进行精确的定量检测，是国标中规定的金标方法，但存在对仪器和操作人员的要求较高、难以对大量样本进行快速检测等问题。为实现更方便快捷、高通量、现场检测的要求，将免疫原理与现代分析技术相结合研究开发新型食品安全快速检测技术，以适用于现场快速检测是目前研究的热点和难点。所有检测方法中，样品的前处理是影响检测结果以及方法推广使用的重要因素。当前的样品前处理方法存在前处理复杂、耗时长、效率低的缺陷，开发快速、简单、高效的样品前处理方法来有效富集AFT 是未来开发检测方法的关键。

表1 常见黄曲霉毒素的检测方法Table 1 The common detection methods of aflatoxins

5 小结

AFT 毒性极强，在自然界中分布广泛，已经严重威胁人类健康，对畜牧业、饲料行业、食品工业、药业等也造成了严重的经济损失。各国政府、企业、消费者以及相关专家迫切需要使用最经济、最有效的手段来检测食品中AFT 含量。传统的色谱、质谱等仪器检测方法准确率高、灵敏度高、重复性好，是国标中使用的方法，但设备昂贵、检测程序复杂，不适于大批量样品的检测，难以满足基层监管过程中快速出检测结果的需求，不便推广应用。随着现代科学技术不断发展，开发快速、简便、特异、灵敏、低耗的AFT 检测方法是未来发展的方向，其中比色法快速、简便，结果可以通过肉眼直接观察，具有现场应用潜力。荧光法具有高度特异性和灵敏性。免疫层析法制作简单、成本低，适用于现场检测，是快速筛选食品和原材料的有效方法。电化学法具有灵敏度高、可微型化、可再生的优点，商业化程度较高，已被证明是很有实际应用价值的检测方法。光谱法能实现AFT 含量的现场快速检测，其中近红外光谱可用于AFT 的在线快速筛查，具有很强的应用潜力。以上方法有各自的优势与特色，需要结合实际情况选取合适的检测方法。相信随着新技术和新材料的发展，AFT 检测方法将在未来得到更多的发展，以满足灵敏、简便、智能和便携的检测需求。