60Co-γ辐照和EMS对薏苡种子萌发及幼苗生长的影响

杨玲玲， 刘凡值， 孟庆杨， 申 刚

(1.贵州省农业科学院亚热带作物研究所， 贵州 兴义 562400；2.贵州师范大学生命科学学院， 贵阳 550006)

薏苡(Coixlacryma-jobiL.)是重要的药食同源经济作物，既是营养成分丰富的小杂粮，又是药效广泛的中药材，整个植株均含有多种功能活性成分，包括油脂、多酚、类黄酮、多糖、维生素及矿物元素等。薏苡具有多种保健功能，但是，目前生产用种相对单一，单产不高，综合性状差，优质薏苡新品种缺乏，严重制约了薏苡生产的发展，亟需大力开展薏苡的遗传育种研究，以推进薏苡种植业的良好发展[1-2]。

人工诱变育种是通过利用物理、化学等因素来诱发作物产生所需性状的育种方法。该育种方法能够有效解决种质资源匮乏的问题，且操作简单、成本较低、大小规模均可运用[3]。60Co-γ射线和EMS是实践中常用的两种诱变剂，其中60Co-γ射线是一种相较于其他辐射源(X射线、β射线、激光、中子、紫外线、离子束等)更具能量及穿透性的电磁辐射形式[4-7]，能破坏或改变作物细胞的重要成分，且不同辐射剂量对作物在形态、生理生化等方面产生不同的影响；EMS能通过核苷酸取代，特别是通过鸟嘌呤烷基化，让作物遗传物质产生随机突变[8-9]，因此，60Co-γ射线诱变和EMS诱变被广泛地应用到作物新品种育种中，例如水稻[10]、小麦[11]、高粱[12]、大豆[13]、甘蔗[14]等。相关研究显示，诱变剂处理作物时，剂量的变化可以调节突变的频率及饱和度，则对作物产生不同影响，并且不同诱变剂对同种作物产生的影响也不同，John等[15]研究发现，在相关作物中EMS诱变比物理诱变剂更有效。因此，探究适合的诱变剂及适宜的剂量(特别是半致死剂量)对高效、合理地开展人工诱变育种工作具有重大意义。

目前，在薏苡人工诱导育种工作中，利用辐射诱变进行新种质创制的研究还比较少，如沈晓霞等[16]、刘鹏飞等[17]分别初步探讨了γ射线对薏苡种子的诱变作用，但利用EMS等化学诱变剂处理薏苡的研究未见报道。本研究分别探讨了60Co-γ射线和EMS对薏苡CDT及Y 159的诱变作用，旨在筛选60Co-γ辐照和EMS诱变薏苡种子的最适剂量(浓度)，为薏苡相关育种工作提供一定的理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

本试验材料为泰国栽培型薏苡CDT、中国云南野生薏苡Y 159。

1.2 方 法

将每种材料的2 100粒去壳种子平均分成7袋。分别用7个剂量(150、250、350、450、550、650、750 Gy)的60Co-γ射线对种子进行辐照处理，未经辐照处理(0 Gy)的种子作为对照(ck)。将去壳的薏苡Y 159种子分成13袋(每袋100粒)，分别放入不同浓度(0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%、2.8%、3.2%、3.6%、4.0%、4.4%、4.8%、5.2%)EMS处理液中浸泡10 h，未经EMS处理的为对照组，每个处理重复3次。10 h后，从EMS处理液中取出种子，用无菌蒸馏水冲洗5次，以避免过度处理和EMS的残留。

将处理组及对照组种子分别种植在盛有泥炭藓的育苗盘中，种子深度为1 cm。将育苗盘置于温度为26 ℃、相对湿度为80%的温室中，每2天浇水一次。进行数据收集，从播种后第12天开始，按公式计算每批种子的发芽率。

发芽率(%)=(发芽数/供试种子总数)×100%，

根据发芽率计算半致死剂量。

苗长出3～4片叶片(播种后25 d)后测量幼苗株高(测苗基部至根尖的长度)。根据对照植株的特性计算突变率。

突变率(%)=(突变株数/总株数)×100%。

对数据进行整理及分析。

2 结果与分析

2.1 不同60Co-γ剂量辐照对薏苡种子萌发的影响

薏苡种子在播种后的第4天开始萌发，第12天萌发结束。观察结果显示，随着辐射剂量的增加，2个薏苡品种(CDT和Y 159)种子萌发均发生延迟，且当辐照剂量超过350 Gy时延迟效果明显；低剂量辐射能提高薏苡种子(CDT和Y 159)的发芽率，第4天和第5天，150 Gy和250 Gy辐照种子的发芽率显著高于对照，且不同品种的发芽率不同(表1)。

表1 不同60Co-γ剂量辐照对播种后4、5、6、8、12 d薏苡种子发芽率的影响

分析可知，所有剂量的辐照对薏苡种子萌发均有显著影响，随着辐照剂量的增加，发芽率逐渐降低，并且辐照剂量对薏苡种子萌发的影响因品种而异，其中对薏苡Y 159种子萌发的影响较为明显。具体来看，对于薏苡Y 159，0 Gy辐照处理和150 Gy辐照处理的发芽率均显著高于其他处理组种子的发芽率，且当辐照剂量超过450 Gy时，几乎所有种子都不能萌发；对于薏苡CDT，0 Gy辐照处理和250 Gy辐照处理的发芽率均显著高于其他处理组种子的发芽率，且辐照对薏苡CDT种子萌发的影响较小，当辐照剂量达到750 Gy时仍有10.7%的种子发芽。因此，根据以上测量的不同60Co-γ剂量辐照下的种子发芽率，初步可知150～450 Gy的辐照剂量适合薏苡CDT和Y 159(表2)。

表2 不同60Co-γ剂量辐照下薏苡CDT和Y 159种子的发芽率

2.2 不同60Co-γ剂量辐照对薏苡幼苗生长的影响

在播后25 d时，对薏苡植株的突变率和株高进行了测定，其中植株突变的判断标准是辐照植株与对照植株(0 Gy)表现出不同的叶形时，则为突变体。结果(表3)显示，薏苡CDT和Y 159植株的突变率随辐照剂量的增加而增加，低剂量辐照对植株突变率影响不大，但从250 Gy开始，随着辐照剂量的增加，突变率急剧增加，在450 Gy时突变率几乎达到100%。辐照剂量对薏苡幼苗生长速率也有显著影响，随着辐照剂量的增加，幼苗株高逐渐降低，进一步分析可知，150 Gy以上的辐照显著抑制薏苡幼苗生长，且呈剂量依赖性，而辐照剂量达到450 Gy及以上，幼苗停止生长。因此，由上可推断辐照剂量对2个薏苡品种的幼苗生长均有显著影响。

表3 不同60Co-γ剂量辐照下薏苡植株突变率及株高

2.3 EMS处理对薏苡种子萌发及幼苗生长的影响

由表4可知，不同浓度EMS诱变剂对薏苡Y 159的种子发芽率和幼苗的突变率、株高有显著影响。结果显示，随着EMS浓度的增加，种子发芽率逐渐降低，且当浓度低于1.2%时，发芽率受影响程度不大，高于1.2%时，发芽率明显受影响，而当浓度大于4.4%时，Y 159种子的发芽率接近于零；EMS浓度对幼苗突变率也有很大影响，虽然低浓度EMS对突变率无显著影响，但当浓度高于1.2%时，随着浓度的增加，突变率逐渐显著增加，且当浓度高于4.0%时Y 159植株的突变率达100%；另外，幼苗的生长对EMS也很敏感，当EMS浓度大于0.4%时，生长速率受到影响，当浓度超过1.2%时，生长速率显著下降，而这种抑制作用在2.0%、2.4%、3.2%、3.6%和4.0%时略有减轻，表明EMS对幼苗株高的影响并不是完全由EMS浓度决定的。

表4 EMS处理对薏苡Y 159的种子发芽率和幼苗突变率、株高的影响

2.4 60Co-γ辐照和EMS诱变下薏苡半致死剂量的研究

根据种子发芽率[18]，利用统计软件SPSS 20.0确定半致死剂量(LD50)。结果表明，60Co-γ辐照处理下，薏苡CDT和Y 159的回归方程各为LD50=2.222-0.005X和LD50=2.053-0.007X(X=种子发芽率)，则计算出薏苡CDT和Y 159的半致死剂量分别为406.305 Gy和284.795 Gy；EMS诱变处理下，薏苡Y 159的回归方程为LD50=1.807-0.737X，X为种子发芽率，计算出薏苡Y 159的半致死剂量为2.453%。

3 结论与讨论

人工诱变方法能够在任何作物中短时间内高效获取大量无序的突变后代，是一种获得育种资源的有效途径。本研究结果显示，经过诱变处理后，薏苡种子的萌发受到了明显的抑制，萌发时间延迟，且随着诱变剂浓度(剂量)的增加，种子的发芽率呈逐渐下降的趋势，与Datir等[19]在木豆中的研究结果相一致，Kumar[20]研究发现，黄秋葵的发芽率通常随着γ射线剂量和EMS浓度的增加而降低；松属植物[21]、鹰嘴豆[20]等的发芽率也随着γ辐照剂量的增加而降低。相关研究表明，在诱变剂处理下，种子发芽率降低可能是由诱变剂对种子分生组织产生影响而导致的[22]，由此推测在高剂量60Co-γ和高浓度EMS诱变下，薏苡种子发芽率变低可能是由于这两种诱变剂分别对薏苡种子在细胞水平上产生了物理或生理水平的干扰。

本试验中出现的薏苡种子发芽率、幼苗突变率依赖诱变剂剂量变化而变化以及不同诱变剂对不同品种的薏苡产生的影响不同的现象，表明选择合适的诱变剂及剂量是实践中薏苡诱变育种成功的关键。在利用物理或化学诱变剂对相关作物进行人工诱变时，半致死剂量被认为是用来处理原始材料的最佳剂量[18]。经计算可知，在60Co-γ辐照处理下，薏苡CDT和Y 159的半致死剂量分别为406.305 Gy和284.795 Gy，在EMS诱变处理下，薏苡Y 159的半致死剂量为2.453%，由此可以进一步推测，相较于薏苡CDT，Y 159对60Co-γ辐照更敏感，且对于同种作物不同品种的诱变原始材料，其适宜的诱变剂处理浓度不相同。

本研究结果表明，利用不同诱变剂以及同种诱变剂不同处理浓度(剂量)进行诱变处理时，薏苡CDT和Y 159幼苗发生显著突变，主要表现为叶型变异以及株高显著降低，这与沈晓霞等[16]的研究结果相一致。其中薏苡Y 159作为野生薏苡，具有品质优、抗性好、产量高和多年生等优点，是优异的育种原始材料，但与其他野生薏苡资源一样，Y 159植株高度过高，不抗倒伏，而本研究60Co-γ辐照和EMS处理能降低薏苡幼苗株高，有望为以后在薏苡种质创新中更好地利用野生薏苡资源提供参考。