玉米半乳糖代谢相关酶蛋白基因的克隆及表达

杨海鹏， 曹 丹， 刘小红， 陈 伟， 张红梅， 刘娅娟

(1.山西省农业科学院玉米研究所， 山西 忻州 034000；2.西华师范大学生命科学学院， 四川 南充637000)

玉米(ZeamaysL.)是世界上最主要的三大禾谷类作物之一，起源于中美洲和南美洲的热带和亚热带地区的高地，适宜于较温暖的环境。虽然光照、温度、水分、CO2等生态条件对玉米生长都有影响，但温度始终是影响玉米生长发育的重要因素之一[1]。近年来，随着全球气温的升高及极端高温天气的频发，高温已成为限制作物生产的重要非生物胁迫因子之一。高温胁迫会影响玉米开花、授粉和籽粒灌浆，导致结实率下降，从而降低玉米产量。因此，高温对玉米生产的不利影响越来越受到关注。

玉米开花散粉期，在中国黄淮海地区、西南部分地区特别容易遭遇高温天气，导致玉米花粉活力下降，严重影响玉米的受精结实，玉米产量大幅下降[2]。但是，不同玉米品种对高温天气的耐受性存在差异[3]，当前绝大多数品种都不耐高温，但经过育种家们的努力，现也选育出少量耐高温的玉米品种，如中地88，在散粉期遭遇42 ℃的高温，其花粉活力几乎不受影响。因此，研究玉米花粉耐高温胁迫的分子遗传机制具有重要意义。

半乳糖是动植物体内一种重要的单糖，主要由乳糖分解而来，可以经一系列代谢步聚转换成葡萄糖、果糖或其他小分子物质，从而被细胞吸收利用[4]。体内的半乳糖代谢具有非常复杂的通路，涉及许多的酶和其他小分子辅助物参与。其中，ATP依赖的6-磷酸果糖激酶(ATP-dependent 6-phosphofructokinase,ATP-PFK)、半乳糖异构酶(galactose mutarotase,GalM)和己糖激酶(hexokinase,HXK)等都是在半乳糖代谢通路中的重要酶蛋白。这些酶除参与半乳糖代谢外，还具有很多其他的生物学功能[5-6]，如HXK在糖酵解途径中，是糖氧化反应过程的限速酶或称关键酶[7]。因此，克隆分析这些酶蛋白基因具有重要的生物学意义。

基因差异表达分析是克隆耐逆境胁迫基因的重要手段，转录组测序又是实现这一目的的强大工具[8-10]。目前，转录组测序技术已广泛应用于作物物种发现差异表达基因，包括水稻[11-12]、玉米[13-14]、小麦[15-16]、大豆[17]、大麦[18]、高梁[19]、棉花[20]等。基于此，本研究借助转录组高通量测序技术，以高温环境下具有不同耐高温胁迫能力的玉米品种的花粉为材料，对ATP依赖的6-磷酸果糖激酶基因、半乳糖异构酶基因和己糖激酶基因进行了克隆测序分析，并进一步对这几个基因在花粉细胞中的差异表达及酶参与的半乳糖代谢通路进行详细分析，以了解这些基因和表达酶蛋白的结构和功能，为玉米其他代谢通路的类似研究提供分子参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为中地88(耐高温胁迫)和先玉335(不耐高温胁迫)两个玉米品种。

1.2 方 法

1.2.1玉米半乳糖代谢相关基因的克隆

在42 ℃高温的田间大棚里取2个材料的花粉，每个材料设置3个生物学重复，进行转录组测序分析，从转录组测序结果文件中搜索得到与玉米半乳糖代谢相关的差异表达基因的序列信息。

1.2.2基因及蛋白的生物信息学分析

基因的编码信息及表达蛋白的生物学特性由网络在线工具分析完成，具体包括：

1)开放阅读框https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/；序列同源比对：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/；

2)蛋白理化性质：https://web.expasy.org/protparam/；

3)蛋白功能位点：https://prosite.expasy.org/；

4)蛋白结构：①保守结构域：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi/；②二级结构：http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/；③三级结构：https://www.swissmodel.expasy.org/。

1.2.3基因的差异表达分析

基于转录组测序，对半乳糖代谢相关基因的表达进行统计，包括五个参数：

1)平均表达量：进行差异比较的两组全部样品该基因read count的均一化结果；

2)对照表达量：对照组全部样品该基因read count的均一化结果；

3)处理表达量：处理组全部样品该基因read count的均一化结果；

4)差异倍数：在基因的两组表达量，较大值与较小值之比；

5)显著性p值：差异显著性统计值。

1.2.4半乳糖代谢通路分析

利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)工具分析本试验中与半乳糖代谢相关的基因表达的酶蛋白在代谢通路中所处位置，分析酶催化的化学反应中的底物和产物。

2 结果与分析

2.1 基因克隆

通过对中地88和先玉米335的花粉细胞的转录组测序，获得了4个与玉米半乳糖代谢相关的差异表达基因，包括2个ATP-PFK基因(zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2)，1个GalM基因(zm-zx-gm)和1个HXK基因(zm-zx-hxk)。这4个基因的cDNA全长分别为2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都为断裂基因，含有大量内含子序列，分别位于第6、6、2号和3号染色体上。

2.2 基因编码蛋白分析

2.2.1开放阅读框和同源比对分析

对半乳糖代谢相关的4个基因编码蛋白的开放阅读框进行分析，结果如图1～图4所示。zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因全长为348个、288个、370个和407个，都含有20种不同氨基酸，带负电荷氨基酸(Asp+Glu)含量分别为：49、31、34、54，带正电荷的氨基酸(Arg+Lys)含量分别为：38、33、34、42。

利用NCBI网站的Protein Blast工具对这4个基因的编码蛋白作同源性搜索，结果显示，zm-zx-pfk1基因与玉米、高粱(Sorghumbicolor)和甘蔗(Saccharumofficinarum)的ATP-PFK基因的一致性分别为100%(XP_008649908.1)、95.45%(OQU 78332.1)和96.56%(AWA 44824.1)；zm-zx-pfk2基因与玉米、高粱和甘蔗的ATP-PFK基因的一致性分别为100%(AQK 87784.1 AQK 80438.1)、91.79%(XP_002437847.1)和93.28%(AGT16840.1)；zm-zx-gm基因与玉米GalM基因的一致性为100%(ONM 16962.1 AQK 80438.1)，与玉米、高粱和小米(Setariaitalica)的醛糖-1-异构酶基因的一致性分别为98.66%(PWZ 38696.1)、87.50%(XP_002446609.1)和82.09%(XP_004975841.1)；zm-zx-hxk基因与玉米、小米和高粱的HXK基因的一致性分别为95.90%(ONM 38338.1AQK 80438.1)、92.09%(XP_004969912.1)和79.31%(XP_002458467.1)。

2.2.2理化性质分析

对玉米半乳糖代谢相关的4个基因的理化性质利用在线工具ProtParam进行预测，结果如表1所示。这4个基因的分子量都较大，其分子量大小与所含氨基酸数量呈正相关；从等电点可以看出，zm-zx-pfk1和zm-zx-hxk显酸性，而zm-zx-pfk2和zm-zx-gm显碱性；从不稳定指数、脂肪族指数和平均亲水系数可以看出，这4个基因的编码蛋白均属稳定亲水性蛋白。

表1 玉米半乳糖代谢相关基因编码蛋白的理化性质

此外，还对这4个基因的编码蛋白利用网络在线工具NetPhos 3.1作了磷酸化修饰分析，结果表明，m-zx-pfk1基因编码蛋白含有17个丝氨酸位点、11个苏氨酸位点和8个酪氨酸位点；zm-zx-pfk2基因编码蛋白含有9个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和5个酪氨酸位点；zm-zx-gm基因含有13个丝氨酸位点、14个苏氨酸位点和4个酪氨酸位点；zm-zx-hxk基因编码蛋白含有15个丝氨酸位点、10个苏氨酸位点和6个酪氨酸位点。

2.2.3功能位点分析

利用网络在线工具Prosite对半乳糖代谢相关的4个基因的编码蛋白的功能位点进行预测，含有的功能位点种类、数量及在氨基酸序列中的位点见表2。在这5种功能位点中，zm-zx-pfk2基因编码蛋白最少，只含有3种(2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、6个蛋白激酶C磷酸化位点和8个cAMP和cGMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点)；zm-zx-pfk1基因编码蛋白有4种(10个N-豆蔻酰化位点、2个N-糖基化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和6个蛋白激酶C磷酸化位点)；zm-zx-gm基因编码蛋白也含有同样的4种(9个N-豆蔻酰化位点、2个N-糖基化位点、5个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和6个蛋白激酶C磷酸化位点)；zm-zx-hxk基因编码蛋白含有的功能位点种类最多，包含了全部5种(11个N-豆蔻酰化位点、2个N-糖基化位点、7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、1个蛋白激酶C磷酸化位点和1个cAMP和cGMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点)。

表2 玉米半乳糖代谢相关基因编码蛋白的功能位点

2.2.4结构分析

利用保守结构域在线工具Conserved Domains对zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因编码蛋白进行分析，结果表明，分别含有磷酸果糖激酶结构域(85-348)、磷酸果糖激酶结构域(62-261)、醛糖-1-异构酶结构域(27-369)和己糖激酶结构域(2-405)。半乳糖异构酶属于醛糖-1-异构酶。

对4个基因表达蛋白的二级结构利用网络在线工具Psipred进行分析，结果显示，zm-zx-pfk1基因编码蛋白有12个螺旋区，12个折叠区；zm-zx-pfk2基因有6个螺旋区，11个折叠区；zm-zx-gm基因编码蛋白有5个螺旋区，23个折叠区；zm-zx-hxk基因编码蛋白有13个螺旋区，12个折叠区。除螺旋区和折叠区外，这4个基因都含有大量无规则卷曲区。

对4个基因表达蛋白的三级结构利用网络在线工具SWISS-MODEL分析完成，zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk基因编码蛋白的模型1的参照模板分别为6 qu 5.1.A、6 qu 3.1.A、1 snz.1.A和6 jj7.1.A，其对蛋白名称的描述与保守结构域在线分析结果完全一致。

2.3 基因表达分析

本试验中克隆的4个半乳糖代谢相关基因在中地88(处理)和先玉335(对照)两个玉米材料中的表达情况作统计分析，结果如表3所示。从表3可以看出，这4个基因的表达均呈极显著差异，其中zm-zx-pfk1基因上调表达，其差异倍数高达26.19；zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk三个基因表现相反，为下调表达，其差异倍数分别达到2.86、3.94倍和2.64倍。

表3 玉米半乳糖代谢相关基因的表达统计

2.4 代谢通路分析

本试验中的这4个基因编码蛋白都参与了半乳糖代谢，在半乳糖代谢通路中所处位置如图5所示。在通路2.7.1.11(紫色)位置包括了zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2两个基因的编码蛋白，这两个基因表达模式相反，其中zm-zx-pfk1为上调表达基因，而zm-zx-pfk2为下调表达基因，这两个基因都表达ATP依赖的6-磷酸果糖激酶，虽然这两个基因表达的蛋白不同，但都处在这个通路位置，具有相同的功能，都是促进D-塔格糖-1,6-二磷酸(D-Tagatose-1,6 P 2)与D-塔格糖-6磷酸(D-Tagatose-6 P)的相互转化。在5.1.3.3(绿色)位置包括了zm-zx-gm基因的编码蛋白，该基因为下调表达基因，表达的半乳糖异构酶催化D-半乳糖(D-Galactose)转化为α-D-半乳糖(α-D-Galactose)。在2.7.1.11(绿色)位置包括了zm-zx-hxk基因的编码蛋白，这个基因为下调表达基因，表达的己糖激酶催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)和α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)相互转化。

3 讨论与结论

3.1 讨 论

在半乳糖代谢的KEGG通路中，D-半乳糖通过Leloir途径产生更有利于代谢利用的D-葡萄糖-1-磷酸，在这个过程中，需要多个酶参与，其中GalM是第一步需要的酶。关于半乳糖异构酶已有一些研究，如Scott A等[21]从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中鉴定了一个GalM，并对其生物学活性作了一些鉴定。本试验在玉米中鉴定的zm-zx-gm基因就可以表达GalM，该酶可以催化D-半乳糖转变为α-D-半乳糖，α-D-半乳糖再进一步在半乳糖激酶的作用下，转变为α-D-半乳糖-1-磷酸。基因表达结果显示，zm-zx-gm基因在先玉335(ck)花粉中的表达量较高，而在中地88花粉中表达量较低，为下调表达，其差异倍数达到3.94倍。

ATP-PFK可以在有ATP提供磷酸基的情况下，催化果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸，该酶目前已在细菌和一些真核生物中被鉴定[22-24]，如Hansen等[25]鉴定了一个来自嗜热细菌海栖热袍菌(Thermotogamaritima)的ATP-PFK，大小为140 kDa，是一个同源四聚体蛋白，单个亚基为34 kDa，ATP-PFK是经典Embden-Meyerhof途径糖酵解的关键酶之一[26]。在本试验中，zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2两个基因的ATP-PFK表达物在KEGG通路中，参与了半乳糖代谢，其功能是催化D-塔格糖-6磷酸转化为D-塔格糖-1,6-二磷酸(塔格糖是果糖的一种异构物)，但这两个基因的表达物是不同的依赖于ATP的6-磷酸果糖激酶，zm-zx-pfk1基因表达蛋白分子量较大，pH值小于7，呈酸性，而zm-zx-pfk2基因的表达蛋白分子量较小，但pH值要大得多，呈碱性。在玉米花粉细胞中，zm-zx-pfk1基因上调表达，差异倍数超过26倍，zm-zx-pfk2则相反，为下调表达，但差异倍数仅有2.86倍。

HXK在植物中是唯一能磷酸化修饰葡萄糖的一种激酶，同时还能磷酸化修饰果糖[27-28]，除了其催化磷酸化活性外，HXK还有其他一些生物学活性[29]，如可以作为糖传感器发挥作用，而不依赖于其磷酸化活性[5]；可以感知葡萄糖和果糖的水平，并产生激活关闭气孔的脱落酸(ABA)途径的信号[30]。本研究中，zm-zx-hxk基因表达的HXK在半乳糖代谢的KEGG通路中，具有一样的活性，可以催化α-D-葡萄糖转化为α-D-葡萄糖-6-磷酸，使得α-D-葡萄糖进入糖酵解途径，从而被代谢利用。但是这个基因在不同玉米材料中呈现差异表达，本试验中，在先玉335中表达量明显高于中地88，其差异倍数达到了2.64倍。

上述4种酶都是KEGG半乳糖代谢通路中非常重要的酶，本试验在高温胁迫条件下，对玉米花粉细胞中的这4个酶基因的结构和差异表达作了相关分析，为进一步的基因克隆及功能分析提供了分子基础。这4个基因的表达与玉米耐受高温胁迫的关系，以及玉米细胞中相关酶蛋白的纯化及功能鉴定尚需进一步研究。

3.2 结 论

本研究以耐高温胁迫差异明显的两个玉米品种材料，在高温环境对其花粉细胞的转录组进行测序分析，克隆得到4个与半乳糖代谢相关的基因(zm-zx-gm、zm-zx-pfk1、zm-zx-pfk2和zm-zx-hxk)，并对这几个基因作了进一步的结构和表达分析，结果如下：

1)生物信息学分析结果表明：这4基因全长分别为2 555 bp、2 775 bp、1 380 bp和2 256 bp，都为断裂基因，含有大量内含子序列，分别位于第6、6、2号和3号染色体上。其开放阅读框分别可以编码348、288、370个和407个氨基酸。并进一步对其编码的蛋白的理化性质、功能位点及结构作了分析，所有这些结果都显示，zm-zx-gm基因编码半乳糖异构酶；zm-zx-pfk1基因和zm-zx-pfk2基因编码不同的磷酸果糖激酶；zm-zx-hxk基因编码己糖激酶。

2)基因表达分析结果显示，这4个基因在两个玉米花粉细胞中呈现明显的差异表达，以高温敏感材料先玉335为对照，在处理材料中地88中，zm-zx-pfk1基因上调表达，差异倍数高达26.19倍，zm-zx-pfk2、zm-zx-gm和zm-zx-hxk3个基因则相反，为下调表达，差异倍数分别为2.86，3.94倍和2.64倍。

3)KEGG通路分析结果表明，这4个基因的表达产物都参与了半乳糖代谢，zm-zx-gm基因产物催化D-半乳糖(D-Galactose)转化为α-D-半乳糖(α-D-Galactose)；zm-zx-pfk1和zm-zx-pfk2基因产物都是促进D-塔格糖-6磷酸转化为D-塔格糖-1,6-二磷酸，但反应是可逆的；zm-zx-hxk基因产物表达催化α-D-葡萄糖(α-D-Glucose)转化为α-D-葡萄糖-6-磷酸(α-D-Glucose-6P)，该反应也可逆。

本试验结果丰富了玉米细胞中半乳糖代谢途径中的基因和酶蛋白信息，为进一步酶的纯化及功能分析奠定了分子基础，也为其他植物的类似研究提供了参考。