腺苷酸琥珀酸合成酶2对肝癌细胞迁移作用的研究

成 睿 赵 琴 蒋玉辉

肝癌是最常见的肿瘤之一，其发生率位于全球第6位，并且在肿瘤相关的死亡中排名第4位[1]。肝癌是一个病因复杂的疾病，而乙型肝炎-肝硬化-肝癌是最常见的肝癌发展进程之一[2，3]。我国作为一个乙型肝炎大国，肝癌的发生率日益增高，且大多数患者就诊时已处于晚期阶段，目前我国肝癌的5年生存率仅为12.1%[4～6]。因此阐明肝癌发生的分子机制并确定有效的分子靶标对于肝癌的早期诊断及治疗具有重要意义。

嘌呤核苷酸是生命活动所必须的有机低分子，它不仅是DNA及RNA的基本成分，还是体内重要的能量来源，它的合成途径分为从头合成及补救途径两种方式[6]。越来越多的证据表明在癌变的过程中存在嘌呤核苷酸的代谢失衡，且其合成与分解的代谢异常与肿瘤发生、发展密切相关[7～9]。肝脏作为嘌呤核苷酸最主要的合成器官，为人体的正常生命活动提供了充足的原料。而在肝癌发生时，合成嘌呤核苷酸的代谢酶异常活跃，腺苷酸琥珀酸合成酶作为嘌呤从头合成的关键酶，参与了IMP向ATP转化的第1个步骤，而腺苷酸琥珀酸合成酶2(adenylosuccinate synthase isozyme 2，ADSS)是其在肝脏中的存在形式，在肿瘤发生时异常表达，而其在肿瘤发生、发展中的功能至今未能阐明[10]。

本研究在对公共数据库探索的基础上，利用肝癌细胞探索ADSS在肝癌中的表达及其在肝癌发生、发展中的作用，为其作为肝癌早期诊断及治疗靶点提供依据。

材料与方法

1.实验材料：(1)细胞株：人肝脏细胞株LO2、人肝癌细胞株HepG2、Huh7和Hep3B购自ATCC细胞库，人肝癌细胞株LM3和MHCC-97H购自复旦大学IBS细胞资源中心。(2)主要试剂及耗材：无内毒素质粒小提中量试剂盒和凝胶纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司。限制性内切酶AgeⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ、Phanta保真酶、T4 DNA连接酶及Script SYBR Green PCR 购自美国Thermo Fisher Scientific公司。DH5α、结晶紫溶液、腺苷-5-单磷酸二钠盐和4%多聚甲醛购自生工生物工程股份有限公司。Transwell小室购自英国Corning公司。抗体ADSS购自英国Abcam公司，N-cadherin、E-cadherin及GAPDH购自美国Santa Cruz公司，Vimentin购自美国Proteintech Group公司，Flag 购自美国Sigma-Aldrich公司。

2.实验方法：(1)数据获取：UALCAN网页分析TCGA中ADSS的表达，数据包括371例肝癌组织与50例正常组织。使用Kaplan-MeierPlotter对肝癌患者的5年生存期进行分析，生存期分析中按ADSS的中位表达量将其分为低表达ADSS的肝癌患者(180例)和高表达ADSS的肝癌患者(184例)。(2)细胞培养：细胞采用DMEM高糖培养基培养。培养时加入10%的胎牛血清，100U/L的青霉素与链霉素，细胞的培养条件为37℃、95%饱和湿度及5%CO2。(3)蛋白印迹法：裂解液提取细胞的总体蛋白，BCA法检测蛋白质浓度，蛋白印迹法检测蛋白的表达。SDS-PAGE凝胶电泳后，100V恒压转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2h，一抗于4℃摇床孵育过夜，次日用PBST洗3次，每次10min，二抗在室温下孵育2h， PBST洗3次后化学发光成像。(4)质粒构建：shRNA的质粒载体为pLKO.1，酶切位点为AgeⅠ，过表达质粒载体为pLVX-IRES-Neo-3xFlag，酶切位点为EcoRⅠ及BamHⅠ，引物序列详见表1。(5)慢病毒包装：293T提前铺板，密度约为80%～90%，细胞贴壁后，将慢病毒包装质粒pMD2.G，psPAX2、目的质粒及转染试剂加入500μl培液中，混匀后静置15min后加入293T中，培养48h后收集上清，离心过滤后使用。(6)细胞系构建：细胞铺板密度为30%～40%，待其贴壁后，加入2ml病毒，500μl DMEM完全培养基，加入Polybrene筛选细胞，培养箱培育8h，换为2ml完全培养基。两天后添加1μg/ml的嘌呤霉素持续筛选。(7)瞬时转染：由于HepG2敲减稳定株的效果不明显，故使用瞬时转染进行实验，细胞铺板密度约为60%～70%，提前2h换液，将目的质粒及转染试剂加至500μl的培液中混匀，静置15min后加入细胞中，转染24h后进行其他实验。(8)细胞划痕实验：在6孔板背面每隔1cm划线，每孔种入5×105个细胞，待细胞贴壁并长满后使用200μl的枪头划线，PBS冲洗3次后加入无血清培养基，细胞培养箱中培养，在0、24、48h于显微镜下拍照。(9)Transwell实验：Transwell实验采用8μm聚酯膜小室。消化细胞，离心后PBS洗2次，用无血清DMEM重悬细胞，取200μl 含3×105细胞无血清培养基加入小室，下室加入600μl含15% FBS的培养基培养48h，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定20min，PBS清洗后结晶紫染色20min，PBS清洗后用棉签擦拭小室上层，显微镜下取5个视野拍照。(10)实时荧光定量PCR：Trizol法提取细胞RNA,并反转录为cDNA，实验Script SYBR Green PCR 试剂盒及罗氏LightCycler96检测仪检测相关基因的表达。以GAPDH为内参，mRNA的相对表达量采用2-△△Ct法计算，引物序列详见表1。(11)AMP回补实验：腺苷-5-单磷酸二钠盐用稀盐酸溶解，使用PBS将其稀释为100mmol/L的母液。细胞处理浓度为100nmol/L，其对照组加入相应浓度的盐酸。

表1 质粒及实时定量荧光PCR引物

3.统计学方法：使用GraphPad Prism 6.0统计学软件对数据进行统计分析，组间比较采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.ADSS在肝癌中表达量及与肝癌患者的5年生存率相关性：使用UALCAN数据库对TCGA的肝癌组织分析发现在肝癌组织中ADSS的表达上调(图1A)。使用Kaplan-MeierPlotter分析发现ADSS高表达患者5年生存率明显低于ADSS低表达患者(图1B)。随后在蛋白水平进行分析，与肝脏正常细胞LO2比较，肝癌细胞ADSS的表达量增加，而在mRNA水平大多数肝癌细胞表达量增加。

图1 ADSS在肝癌中表达量及肝癌患者的5年生存率相关性A.肝癌组织与正常肝组织ADSS的mRNA表达量；B.ADSS表达水平与患者5年生存率相关性；C.肝癌细胞及正常肝脏细胞ADSS的蛋白表达量；D.肝癌细胞与正常肝脏细胞中ADSS的mRNA的表达量。*P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

2.ADSS沉默效果及肝癌细胞间的黏附性改变：为了探究ADSS在肝癌中的生物学作用，在ADSS表达较高的HepG2及LM3中沉默ADSS基因，蛋白免疫印迹结果显示沉默ADSS的肝癌细胞ADSS的表达量明显下调(图2A、图2B)，并且使肝癌细胞间黏附性发生改变(图2C)。

图2 ADSS沉默效果及肝癌细胞间的黏附性改变A.HepG2细胞ADSS基因沉默效果验证；B.LM3细胞ADSS基因沉默效果验证；C.ADSS基因沉默后细胞黏附性发生改变(×200)

3.ADSS对肝癌细胞的迁移的影响：使用细胞划痕实验对肝癌细胞的迁移能力进行检测，ADSS基因沉默后明显抑制了HepG2及LM3的迁移能力(图3A、图3B)。使用Transwell实验对肝癌的迁移能力进行验证，在HepG2及LM3中沉默ADSS基因后迁移能力明显减弱(图3C)。

图3 ADSS对肝癌细胞的迁移的影响A.细胞划痕实验检测ADSS基因沉默对HepG2迁移功能的影响(×100)；B.细胞划痕实验检测ADSS基因沉默对LM3迁移功能的影响(×100)；C.Transwell实验检测ADSS基因沉默对肝癌细胞HepG2及LM3迁移功能的影响(结晶紫染色，×200)。*P=0.000

4.ADSS对肝癌细胞上皮间质化的影响:使用EMT相关抗体对沉默ADSS的细胞进行检测，结果发现在沉默ADSS的HepG2及LM3中EMT相关指标N-cadherin、Vimentin均较对照组细胞明显下调，E-cadherin较对照组明显增加(图4)。

图4 ADSS对肝癌细胞上皮间质化的影响A.HepG2细胞中ADSS基因沉默后EMT相关指标的影响；B.LM3细胞中ADSS基因沉默后EMT相关指标的影响

5.ADSS基因及代谢产物回补恢复了LM3-Sh-ADSS细胞的迁移能力：为了确定ADSS的表达在细胞迁移中的作用，对LM3-Sh-ADSS2进行基因及代谢产物回补。ADSS的基因回补完全恢复了EMT相关标志物的表达及LM3的迁移能力(图5、图6A)，而在代谢产物回补实验中，由于其下游代谢产物AMP的细胞吸收及利用率有限，其EMT相关分子标志物及细胞的迁移功能仅得到部分回复(图5、图6B)。

图5 ADSS基因及代谢产物回补对EMT相关分子的影响

图6 ADSS基因及代谢产物回补恢复了肝癌细胞的迁移能力A.细胞划痕实验检测ADSS代谢产物回补及基因回补对肝癌细胞迁移功能的影响(×100)；B. Transwell实验检测ADSS代谢产物回补及基因回补对肝癌细胞迁移功能的影响(结晶紫染色，×200)。*P<0.05,**P=0.000

讨 论

肝癌在我国是一种高发生率、高致死率的恶性肿瘤，其发生、发展是一个典型的多阶段演变过程[11～13]。目前肝癌的发病原因及具体机制尚不明确，故笔者以肝癌为研究对象，力图寻找肝癌新的诊断及治疗靶点。肿瘤与代谢是当今生命科学领域新的研究热点之一，多篇文献报道嘌呤在肿瘤发生过程中常存在代谢失衡[14，15]。参与嘌呤核苷酸从头合成及补救途径的多种代谢酶在肿瘤发生时异常上调，并且通过多种途径促进肿瘤的发生、发展[16]。ADSS作为嘌呤核苷酸从头合成中的关键酶，参与ATP的合成，TCGA数据库中显示ADSS在肝癌中高表达，而其在肿瘤中的具体作用及机制至今无人报道，故本文探究了ADSS在肝癌发生、发展中的作用。

本研究通过对TCGA进行研究发现，肝癌组织中ADSS的表达水平明显高于正常组织，且ADSS高表达的肝癌患者较ADSS低表达的肝癌患者5年生存率明显降低，随后对肝癌细胞及肝脏正常细胞的蛋白及mRNA水平进行检测，结果发现与正常肝脏细胞比较ADSS在肝癌细胞表达量增加。沉默肝癌细胞ADSS后发现，ADSS的缺失导致细胞间黏附性的改变，进一步的生理功能研究结果发现ADSS的下调抑制肝癌细胞的迁移能力。因此可以推断ADSS在肝癌的转移中发挥了重要作用。

肿瘤的浸润与转移是肿瘤患者预后不良的重要原因，多篇文献表明肝癌的转移与EMT的过度激活密切相关[17，18]。其常通过改变细胞间及细胞与基质间的相互作用进而促进肿瘤的浸润与转移，而在EMT发生的过程中上皮标志物E-cadherin、Vimentin表达量的减少，间质标志物N-cadherin表达量的增加是其标志性的改变[19]。使用EMT相关抗体检测发现沉默ADSS显著改变EMT相关蛋白的表达，这表明ADSS可能通过激活EMT促进了肝癌的转移，随后对ADSS基因沉默的LM3-ShADSS2进行基因及代谢产物回补，结果发现ADSS的基因及代谢产物回补恢复了ADSS缺失造成的EMT分子标志物及迁移的改变。本研究揭示了ADSS对肝癌迁移的影响，后期笔者将进一步研究ADSS在肝癌中调控的具体机制，进行体内实验探索ADSS在体内存在的意义。

综上所述，ADSS在肝癌中表达量增加，其表达与患者的5年生存率呈负相关，在肝癌中ADSS对肝癌细胞迁移具有一定的促进作用。因此，ADSS或可为肝癌的早期诊断及治疗提供新的思路。