单因素试验结合Box-Behnken设计-响应面法优化舒肝颗粒(广西方)的醇提工艺

梁 芳 黄艳红 龚志强 蒙田秀 吕 潇 陈思宏 谭德慧

广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222

舒肝颗粒(广西方)由夏枯草、茵陈、虎杖等9味药材加工而成，具有疏肝开郁、清热解毒、化湿健脾之功效，是治疗黄疸型及非黄疸型急性肝炎的良方。方中夏枯草为君药，虎杖为臣药，均有保肝作用。临床研究表明，夏枯草所含的迷迭香酸通过减轻肝脏炎症反应，改善肝纤维化，缓解急性肝损伤来保护肝功能[1-2]；虎杖中的虎杖苷具有保护肝脏、抗炎、抗肝癌、降低脂肪肝的作用，大黄素能有效改善肝功能，降低血脂，减轻肝脏炎症[3-4]。本研究采用Box-Behnken设计-响应面法优化舒肝颗粒(广西方)的醇提工艺，为后续舒肝颗粒(广西方)的工艺研究提供参考依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent1200(配置DAD/ELSD检测器)高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；Agilent1200色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；AE240十万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；JJ1000型电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；HH-S6型数显恒温水浴锅 (金坛市医疗仪器厂)。

1.2 对照品与试剂 对照品均购于中国食品药品检定研究院，虎杖苷对照品(批号：111575-201603，纯度87.3%)、迷迭香酸对照品(批号：111871-201706，纯度90.5%)、大黄素对照品(批号：110756-201512，纯度98.7%)；甲醇和乙腈(色谱纯)购自美国Thermo Fisher公司，液相用水为娃哈哈纯净水。

1.3 药材 夏枯草(批号：18102001)、虎杖(批号：18051501)、茵陈(批号：18022701)、北柴胡(批号：18102202)、蒲公英(批号：18082202)、苍术(批号：18092504)、甘草(批号：18102801)均为广西仙茱中药饮片厂生产。马兰草、白茅根购自广西玉林药市，由广西中医药大学中药鉴定教研室田慧教授鉴定，马兰草为菊科植物马兰头(KalimerisindicaL.)的干燥全草，白茅根为禾本科植物白茅(ImperatacylindricalBeauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.)的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 有效成分的含量测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱：0～12 min，20%A、12～20 min，20%→30%A、20～25 min，30%→70%A、25～35 min，70%→80%A、35～40 min，80%→90%A；流速：1.0 mL/min；检测波长：306 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。取混合对照品溶液和供试品溶液进样分析，结果表明混合对照品溶液和供试品溶液在HPLC色谱图中相应色谱峰的保留时间一致，各相邻峰间分离度均大于1.5，理论板数按迷迭香酸峰计不低于6000。HPLC色谱图如图1所示。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 供试品溶液的制备 按处方量的1/20称取药材8.75 g，置250 mL圆底烧瓶中，加入12倍量60%乙醇，称定重量，提取2次，每次回流提取80 min，放冷，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液2 mL,置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，即得。

2.1.3 混合对照品溶液的制备 精密称定迷迭香酸对照品8.58 mg、虎杖苷对照品5.89 mg、大黄素对照品5.29 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇适量，超声使溶解，再加60%乙醇定容至刻度，摇匀，备用。

2.1.4 标准曲线的制备 取“2.1.3”项下的混合对照品溶液，精密量取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，加60%乙醇定容至刻度，摇匀，过微孔滤膜，按“2.1.1”色谱条件进样测定，记录峰面积，以对照品浓度作为x轴，峰面积作为Y轴进行回归分析，得到虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的回归方程分别为：Y=31.193X-11.752，(r=0.9997)、Y=11.445X-4.6137(r=0.9998)、Y=7.0932X+10.846(r=0.9995)。结果表明虎杖苷在5.14～51.40 μg、迷迭香酸在7.76～77.60 μg、大黄素在5.22～52.20 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度考察 精密吸取“2.1.4”混合对照品溶液5#，按“2.1.1”色谱条件连续进样6次，测定虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的峰面积并计算RSD值，结果虎杖苷平均峰面积为1223.98，RSD=0.07%,迷迭香酸平均峰面积为691.97，RSD=0.05%，大黄素平均峰面积为481.15，RSD=0.17%，表明仪器的精密度良好。

2.1.6 稳定性考察 取“2.1.2”项下的同一供试品溶液，在同一色谱条件下分别于0、2、4、8、12、24 h进样分析，计算虎杖苷、迷迭香酸、大黄素峰面积的RSD值，结果分别为0.43%、0.63%、1.45%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.7 重复性考察 按“2.1.2”项下的方法制备6份供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件进样测定。测得虎杖苷平均含量为2.5585 mg/g,RSD=0.87%；迷迭香酸平均含量为1.8457 mg/g,RSD=0.86%；大黄素平均含量为1.8362 mg/g,RSD=1.74%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收考察 分别在已知含量的6份供试品溶液中加入一定量的虎杖苷、迷迭香酸、大黄素对照品，按“2.1.1”色谱条件进样分析，计算平均回收率和RSD值，结果见表1，虎杖苷平均回收率为98.36%，RSD=1.52%；迷迭香酸平均回收率为99.15%，RSD=1.58%；大黄素平均回收率为99.81%，RSD=1.75%，表明该方法准确度良好。

表1 加样回收率试验结果

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数考察 按处方量的1/20称取药材6份，每份8.75 g，置250 mL圆底烧瓶中，固定提取次数1次，加热回流提取60 min，分别精密加入40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇各100 mL, 按“2.1.2”项下的方法制备成供试品溶液，进样分析，测定虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的总含量，结果如图2A所示。结果表明，50%、60%、70%乙醇提取的总含量高，故选择乙醇体积分数为50%～70%进行Box-Behnken设计试验。

2.2.2 提取溶剂加入量考察 按处方量的1/20称取药材8.75 g，共6份，置250 mL圆底烧瓶中，固定提取次数1次，加热回流提取60 min，分别精密加入8倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍的50%乙醇各100 mL，同上法制备成供试品溶液，进样分析，测定虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的总含量，结果如图2B所示。结果表明，加入量在8～12倍时测得的总含量呈上升趋势，在12倍量时达最高点，提取效果最好，在12～16倍时测得的总含量呈下降趋势，16～18倍时总含量平稳，故选择10～14倍进行Box-Behnken设计试验。

2.2.3 提取时间考察 按处方量的1/20称取药材6份，每份8.75 g，置250 mL圆底烧瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，提取次数1次，分别加热回流30、60、90、120、150、180 min， 同上法制备成供试品溶液，测定虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的总含量，结果如图2C所示。结果表明，加热回流60 min时测得的总含量最高，提取时间为120～180 min时虽然提取率有所提高，但考虑到生产实际，为节省生产时间，选择30～90 min进行Box-Behnken设计试验。

2.2.4 提取次数考察 按1/20处方量称取药材8.75g，共3份，置250 mL圆底烧瓶中，固定加入12倍量50%乙醇，分别提取1、2、3次，每次 60 min，同上法制备成供试品溶液，测定虎杖苷、迷迭香酸、大黄素的总含量，结果如图2D所示。结果表明提取2次时测得的总含量最高，提取效果最好。

图2 单因素试验考察结果

2.3 浸膏得率的测定 精密吸取各乙醇提取液 20 mL，照《中国药典》2015年版四部醇溶性浸出物测定法(通则2201)测定，计算浸膏得率Rt (%)。

计算公式：Rt (%)=(M2-M1)/W×V/20×100%

2.4 Box-Behnken设计-响应面法优化醇提工艺

2.4.1 Box-Behnken试验设计与结果 在单因素试验结果的基础上，依据Box-Behnken中心试验设计原理，设计三因素三水平17个实验点的响应面法分析模型，以乙醇的体积分数(A，%)、提取溶剂加入量(B，倍)、提取时间(C，min)为自变量，固定提取次数为2次，以总含量和浸膏得率的综合评分(R)作为本次实验的响应值，因素与水平详见表2，Box-Behnken设计与结果见表3。

表2 因素与水平

2.4.2 模型的建立及显著性检验 通过Design-Expert 8.0.6软件对表3的数据进行回归分析，以乙醇体积分数(A)、提取溶剂加入量(B)、实验提取的时间(C)三个因素对综合评分进行响应面分析，采用多元线性回归以及二次多项式方程对各个数据进行拟合，得回归方程为Y=-295.35850+6.80485A+3.77413B+0.038017C-3.30000×10-3AB+3.50000×10-3AC+6.24444×10-3BC-0.058405A2-0.019758B2-5.44500×10-3C2，方差分析结果见表4。

表3 Box-Behnken设计与结果

表4 方差分析结果

续表4 表4 方差分析结果

由表4可知，该模型P=0.0015<0.05，表明拟合模型具有显著性差异。失拟项P=0.1197>0.05差异不显著，表明该模型的回归方程具有较好的拟合度和可信度，实验误差相对较小。模型的相关系数R2=0.9418，表明该模型可解释3个因素94.18%的变异性，模型可用于醇提工艺中综合评分的预测。该回归模型的显著性检验结果如表3所示，模型的一次项A、C显著(P<0.05)，二次项A2、B2、C2对综合评分的影响非常显著(P<0.01)，BC对综合评分的影响显著(P<0.05)，其他项均不显著。3个因素的主次顺序为：乙醇体积分数>提取时间>提取溶剂加入量，交互项对总含量的影响力强弱顺序为：BC>AC>AB。

2.4.3 响应面分析 利用 Box-Behnken得出的回归模型作出两两因素对综合评分的交互作用响应面曲线图及等高线图，从响应面曲线图可以直观看出各因素的交互作用显著程度以及变化趋势，曲面的倾斜程度反映两因素交互作用的显著程度，等高线的密度反映该因素对综合评分的影响强弱。由图3可知，提取溶剂加入量和提取时间两个因素的交互影响作用最强，故曲线陡峭，等高线呈椭圆形，对综合评分影响显著；乙醇体积分数和提取时间的交互影响较小，等高线接近圆形；而乙醇体积分数和提取溶剂加入量的交互影响最小，作用不显著，等高线呈圆形。各因素对综合评分的影响交互项强弱顺序为：BC>AC>AB，与表3回归系数的显著性检验结果一致。

图3 各因素对综合评分影响的响应面曲线图和等高线图

2.4.4 验证试验 采用Design-Expert8.0.6软件预测最佳醇提工艺参数：乙醇体积分数57.78%，提取溶剂加入量11.84倍，提取时间81.43 min。考虑到生产过程中实施工艺参数的可行性，将最佳醇提工艺条件调整如下：乙醇体积分数为60%，提取溶剂加入量为12倍，提取时间80 min。在此条件下平行进行3次验证试验，结果见表5，测得综合评分99.54%(RSD=0.40%，n=3)，与模型预测值98.16%的相对平均偏差为0.40%，表明该醇提工艺条件稳定、可靠，同时也说明建立的回归模型合理。

表5 验证试验结果

3 讨论

夏枯草的活性成分熊果酸也具有保肝功效，且含量比迷迭香酸高[5-7]。故原计划将熊果酸作为含量测定指标之一，但熊果酸的紫外吸收波长在210 nm左右，且熊果酸和齐墩果酸系同分异构体，化学结构接近，只有一个甲基位置的差异，HPLC法较难把熊果酸峰和齐墩果酸峰分离[8]，只能选择夏枯草另一种活性成分迷迭香峰作为含量测定指标。

本研究以君药夏枯草的迷迭香酸[9]280和臣药虎杖的虎杖苷和大黄素[9]208-209作为含量测定指标，在波长选择时发现虎杖苷峰和迷迭香酸峰在254 nm波长测定时呈现倒峰，大黄素峰在330 nm波长测定时呈现倒峰，只有在306 nm波长测定时3个成分均呈现良好的峰形，且分离度佳，故选择306 nm作为HPLC法的检测波长。

响应面法适宜于解决非线性数据处理的相关问题，它是以多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过回归方程优化工艺参数的综合实验设计方法，广泛应用于中药材及复方制剂的提取工艺条件优化。这种方法突破了正交设计和均匀设计等线性模型，并且在此基础上进行了改进，精密度有了提高，而且可以自动识别自变量以及非自变量之间的规律[10]。本次提取工艺研究是在单因素试验结果的基础上，结果表明，最佳醇提工艺为加入60%乙醇12倍，加热回流2次，每次80 min。经验证，本次实验得到的实验数值与预测数值的偏差为0.46%，表明该醇提工艺条件合理可行，可用于后续舒肝颗粒(广西方)制剂生产的醇提工艺提取。