缺氧预处理后BMSCs 来源外泌体对心肌缺血再灌注大鼠心肌损伤的影响及其机制

王玉梅，韩炜，李惠，张媛，郭艳丹，乔玲玲，许文平

中国人民解放军南部战区总医院门诊部，广州510010

心肌缺血再灌注（I/R）可诱导心肌细胞凋亡、心肌组织坏死甚至心脏骤停，从而影响心脏缺血性疾病的治疗效果［1］。骨髓间充质干细胞（BMSCs）具有多向分化潜能，可参与免疫调节、炎症抑制、多种细胞生长因子的分泌和组织修复［2-3］。研究显示，将BMSCs 移植到缺血心脏后，BMSCs 可以分化为内皮细胞、血管平滑肌细胞，甚至心肌样细胞［4］。因此，BMSCs 在心脏组织修复和再生过程中具有良好的应用前景。但是，BMSCs 移植治疗缺血性心脏病存在移植细胞在缺血区存活率低和栓塞的问题［5］。外泌体是携带DNA、RNA 和蛋白质的小膜泡，作为细胞外信号转导的主要途径之一，其在细胞间交流和相互作用中具有重要作用。最新研究证实，BMSCs能够分泌丰富的外泌体［6］。随着对BMSCs在组织再生中作用的深入了解，越来越多的研究表明BMSCs的这种作用可能与其释放的外泌体有关［7］。因此，BMSCs 来源外泌体可能成为治疗缺血性心脏病的一种新的替代方法。干细胞低氧预处理能有效提高BMSCs 移植后的存活率，增强其对损伤组织的保护作用，因此低氧预处理可增强干细胞的生物学作用［8］。2020 年1—10 月，本研究观察了缺氧预处理后的BMSC 来源外泌体对心肌I/R 大鼠氧化应激和心肌损伤的影响，探讨缺氧预处理对外泌体修复心脏组织功能的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：清洁级雄性SD 大鼠51 只，体质量200 g 左右，8 周龄，购自南部战区总医院医疗保障中心实验动物室。主要试剂：LG-DMEM 完全培养基、胎牛血清购自美国Gibco 公司，Exo Quick TC外泌体提取试剂盒购自美国SBI 公司；TIANscript RT Kit 购自天根生化科技（北京）有限公司，Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits（SYBR Green I）购自意大利BBI 公司，兔抗大鼠缺氧诱导因子1α（HIF-1α）一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；1% TTC染色液购自南京建城生物工程研究所，大鼠超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，大鼠免疫组化总抗氧化力（T-AOC）检测试剂盒购自上海酶联生物研究所。主要仪器：C21三气细胞培养箱购自美国BioSpherix 公司，Prism®7300 型PCR 仪购自美国ABI 公司，Multi-ImageTM凝胶成相系统购自美国Alpha Innotech公司，IX-70型倒置显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 BMSCs分离及缺氧预处理

1.2.1 BMSCs 分离、培养 选取雄性SD 大鼠1 只，采用3% 戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈部脱臼处死后75% 乙醇浸泡10 min。无菌条件下截取大鼠股骨和胫骨的骨骺末端，PBS 反复冲洗骨骺末端骨髓腔，收集冲洗后的PBS。移液器反复吹打，筛网过滤，制成单细胞悬液，1 500 r/min 离心10 min，弃上清液。将细胞密度调整为（1～3）×106/mL，接种至含LG-DMEM 完全培养液的细胞培养瓶中，37 ℃、5% CO2、20% O2、95% 饱和湿度培养箱中培养。细胞培养48 h后弃去培养液，去除非贴壁细胞，加入等量LG-DMEM 完全培养液培养纯化细胞，每3 d 更换1 次LG-DMEM 培养液。待细胞生长融合至80% 左右时，加入0.25% 胰蛋白酶，以1∶3 的比例进行传代。取第3代生长状况良好的细胞进行后续实验。

1.2.2 BMSCs 鉴定 ①收集第3 代生长状况良好且融合达80% 的BMSCs，采用0.25% 胰蛋白酶消化，制成细胞密度为1×106/mL 的单细胞悬液，分别加入荧光直标的CD29、CD34、CD44、CD105 单克隆抗体；混和均匀后，冰上避光孵育30 min，PBS 洗3次，并为每组样品设立单独的阴性对照；采用流式细胞仪检测抗体表达情况，结果显示细胞表面抗原CD34 表达阴性，CD29、CD44、CD105 表达阳性。②取BMSCs 单细胞悬液，镜下观察分离培养的大鼠BMSCs 呈纤维形态或者不规则的梭形贴壁生长。③收集第3 代生长状况良好且融合达80% 的BMSCs，弃去原培养基，分别添加成脂诱导培养基和成骨诱导培养基进行诱导分化培养，每3 d 换液1次，分化12 d；结果显示，细胞成脂诱导后经油红O染色显示含有红色脂肪颗粒，细胞成骨诱导后经茜素红染色显示含有红色的矿化结节。

1.3 BMSCs 缺氧与常氧预处理及其外泌体提取、鉴定

1.3.1 BMSCs 缺氧与常氧预处理 取第3 代生长状况良好的BMSCs，待细胞生长融合至80% 左右时，分为两部分；一部分进行缺氧预处理，即更换无血清培养基，并置于C21 三气细胞培养箱，37 ℃、5% CO2、1% O2、95%饱和湿度条件下培养48 h；另一部分进行常氧预处理，即置于常氧培养箱中，37 ℃、5% CO2、20% O2、95%饱和湿度条件下培养48 h。

1.3.2 BMSCs 来源外泌体的提取、鉴定 取1.3.1中分别经缺氧及常氧预处理48 h 的两部分细胞，收集培养基上清液。 4 ℃条件下1 000 r/min 离心10 min、8 000 r/min 离心20 min，去除细胞和细胞碎片形成的沉淀，将上清液置于新的EP 管中，每500 μL 上清液加入Exo Quiek TC 试剂50 μL；颠倒EP 管约20 次，置于4 ℃冰箱静置约12 h。4 °C 条件下3 000 r/min 离心30 min，去除上清液，保留沉淀。使用移液枪取1×PBS 400 μL，反复均匀吹打离心沉淀物，将重悬液转移至新的1.5 mL EP 管中。透射电子显微镜下观察提取的外泌体形态，结果显示其呈杯状或圆形囊泡，直径50～120 nm，见OSID 码图1。采用Western blotting 法检测外泌体标志物CD9、CD63 表达，结果显示其高表达CD9、CD63。证实在BMSCs培养上清中成功分离出外泌体。

1.4 动物分组处理 取SD 大鼠50 只，称重后采用随机数字表法分为正常组、假手术组、I/R 组、缺氧干预组和常氧干预组，每组10只。I/R组、缺氧干预组和常氧干预组建立心肌I/R 大鼠模型：术前禁食12 h、禁水4 h，3% 戊巴比妥钠30 mg/kg 腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠取仰卧位固定，连接好心电监护；常规手术区域备皮消毒，气管插管后连接ALCV9A 动物呼吸机（参数设置为呼吸比2∶1、20～30 mL/kg、频率70 次/min）；于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，打开心包，充分暴露左冠状动脉前降支；于左心耳根部下方肺动脉圆锥旁以6-0 无创缝合线结扎左冠状动脉前降支以阻断血流，待阻断血流区域心肌颜色由红转白，且心电图显示ST段明显抬高（≥0.15 mV），提示血管阻断成功；结扎阻断血管30 min 后解除阻断，可见心肌颜色由白转红，ST段回落≥50%，提示完成缺血再灌注；逐层关闭胸腔，完全缝合前充分排空左侧胸腔内气体，待大鼠苏醒后拔出气管插管。缺氧干预组和常氧干预组分别在血管结扎后给予缺氧、常氧预处理的BMSCs来源外泌体400 μg/g；假手术组开胸后仅打开心包而不结扎左冠状动脉前降支，正常组常规饲养未接受任何干预。

1.5 心肌组织相关指标观察

1.5.1 心肌梗死面积比测定 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法。各组大鼠干预1 周后经尾静脉注射伊文思蓝（0.1 g/mL）1 mL，1 min后开胸取出心脏，-20 ℃保存20 min。沿纵轴在1.0～1.5 mm处切取4～5 个切片，每个切片用玻片压片，1% TTC 避光染色30 min，10% 甲醛固定10 min，冲洗后采用Imageproplus6.0软件测量梗死区（浅白色）和危险区（砖红色）面积。梗死面积比（%）=梗死区面积/危险区面积×100%。

1.5.2 心肌组织病理观察 取各组大鼠心肌组织，10% 多聚甲醛溶液固定24 h，经梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋、5 μm 厚度切片。HE 染色后显微镜下观察心肌组织病理学改变情况。

1.5.3 心肌组织氧化应激指标表达检测 采用ELISA 法。取各组大鼠心肌组织，冰生理盐水反复漂洗后进行组织匀浆，4 ℃条件下12 000 r/min 离心10 min，取上清。采用ELISA 法检测上清液SOD、MDA、T-AOC表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 BMSCs 来源外泌体HIF-1α 表达检测 取经缺氧及常氧预处理48 h 的BMSCs，参照1.3.2 的方法提取外泌体。①采用实时荧光定量PCR 法。使用TRIzol试剂提取总RNA，cDNA第一链合成试剂盒将RNA 反转录成cDNA。HIF-1α 引物序列：上游引物5′-CTCCCATACAAGGCAGCAGAAAC-3′，下游引物5′-AGAAACGAAACCCCACAGACAAC-3′。 内 参GAPDH 引 物 序 列：上 游 引 物5′-GGCCTTCCGTGTTCCTACC-3′，下 游 引 物5′-ACTCGACACCTGCCCTCA-3′。PCR 反应体系20 μL：cDNA 1 μL，10 μmmol/L PCR上、下游引物各1 μL，SYBR®GREEN master mix 10 μL，Nucleasr-Free Water 7 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，40 个循环；58 ℃退火20s，72 ℃延伸30 s，4 ℃作用5 min。采用2-ΔΔC法计算HIF-1α mRNA 相对表达量。②采用Western blotting 法。 将缺氧与常氧预处理的BMSCs 来源外泌体进行匀浆，使用RIPA 裂解缓冲液从样本中提取总蛋白。采用BCA 法进行蛋白定量检测，取总蛋白40 μg 经8% SDS-PAGE 检测。电泳后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，室温下用5% 脱脂奶粉封闭1 h；加入兔抗大鼠HIF-1α及内参β-actin 一抗（稀释比例均为1∶400），4 ℃孵育过夜；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温下孵育1 h。ECL 法显色，GIS 凝胶图像分析系统照相，Image Studio 图像分析软件分析图片，计算HIF-1α 蛋白相对表达量。

1.7 统计学方法 采用SPSS19.0 统计软件。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，组间和组内比较分别采用成组t检验和配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌梗死面积比比较 正常组、假手术组、I/R 组、缺氧干预组、常氧干预组心肌梗死面积比分别为0、0.12% ± 0.01%、46.25% ± 5.74%、32.55% ± 3.69%、39.48% ± 4.47%；与正常组、假手术组比较，I/R 组、缺氧干预组、常氧干预组心肌梗死面积比均升高；与I/R 组比较，缺氧干预组、常氧干预组心肌梗死面积比均降低，且缺氧干预组降低更明显（P均＜0.05）。

2.2 各组大鼠心肌组织病理结果比较 正常组和假手术组大鼠心肌纤维排列整齐，结构清楚，细胞和间质无明显充血水肿及炎性细胞浸润。I/R 组心肌纤维断裂、排列紊乱，存在细胞间质充血水肿及炎症细胞浸润。与I/R 组相比，缺氧干预组、常氧干预组大鼠心肌纤维断裂、排列紊乱程度及细胞间质充血水肿程度均有所减轻。见OSID码图2。

2.3 各组大鼠心肌组织氧化应激相关指标表达比较 与正常组、假手术组比较，I/R 组、缺氧干预组、常氧干预组心肌组织SOD、T-AOC表达均降低，MDA表达均升高；与I/R组比较，缺氧干预组、常氧干预组心肌组织SOD、T-AOC 表达均升高，MDA 表达均降低，且缺氧干预组变化更明显（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织氧化应激相关指标表达比较（xˉ± s）

2.4 缺氧与常氧预处理BMSCs 来源外泌体HIF-1α表达比较 缺氧预处理BMSCs 来源外泌体中HIF-1α mRNA 和蛋白相对表达量分别为6.84 ± 0.62、7.35 ± 0.86，均高于常氧预处理BMSCs 来源外泌体的4.27 ± 0.39、5.14 ± 4.76（P均＜0.05）。

3 讨论

早期再灌注是抑制心肌缺血发生后进一步组织损伤的惟一途径。然而，缺血心肌组织恢复血流灌注时再灌注区会引起可逆和不可逆的组织损伤，称为心肌I/R 损伤。严重的心肌I/R 损伤最终会导致心力衰竭，因此，减轻心肌I/R 损伤仍是目前治疗心肌缺血性疾病的重点和难点。研究证实，BMSCs 对心肌I/R 具有保护作用，但是移植后的BMSCs 不仅存在存活率较低、遗传不稳定性、功能丧失、免疫抑制和恶性转化等缺陷，且存在伦理学限制，因此严重影响了BMSCs 的治疗效果和临床应用［9-10］。外泌体是细胞分泌的纳米级囊泡，携带大量具有亲本细胞特性的生物遗传分子，并通过细胞间通讯转移来影响受体细胞的功能。外泌体通过介导细胞间的通讯，参与调控包括免疫信号、血管生成、应激反应、衰老、增殖和细胞分化等多个生理病理过程。BMSCs 能分泌多种细胞因子、趋化因子和生长因子，以促进组织修复，而旁分泌是BMSCs发挥功能的主要机制［11］。BMSC 来源外泌体具有多种生物学功能，可以调节先天性和适应性免疫反应，抑制过度炎症反应，促进组织修复。LIU 等［12］研究报道，静脉注射间充质干细胞（MSCs）来源外泌体可以通过抑制TLR4/NF-κB 信号通路来减轻I/R 导致的急性肺损伤。YANG 等［13］诱导MSCs 分化为肝细胞样细胞并提取其外泌体，经尾静脉注入后结果显示能够有效提高肝I/R 小鼠对缺血的耐受性，减少肝细胞凋亡，进一步发现自噬增强可能是外泌体保护肝脏免受I/R 损伤的相关机制。因此，BMSCs 来源外泌体可能是BMSCsC 移植治疗的非细胞替代方案。

本研究从大鼠骨髓组织中分离培养BMSCs，并且采用Exo Quick TC 法从BMSCs培养基上清中分离外泌体，通过镜下观察形态特征以及Western blotting 法检测特异性分子标记，证实为BMSCs 来源外泌体。虽然既往有研究显示，BMSCs 来源外泌体在改善器官组织I/R 方面具有良好效果［14］。但也有研究发现，在常氧（21% O2）条件下培养的MSCs 会导致细胞过早衰老和分化能力降低，但缺氧预处理可显著提高MSCs 在宿主环境中的生存能力和再生能力，从而增强其在各种疾病模型中的治疗效果［15］。由于旁分泌是BMSCs 的主要作用机制，因此理论上缺氧预处理能够导致BMSCs 来源外泌体成分发生变化，进而影响其作用效能。ROTH 等［16］研究发现，缺氧预处理BMSCs 的培养基能有效恢复大鼠视网膜缺血模型的视网膜功能，且其效果优于常氧条件下的BMSCs 培养基。本研究结果显示，采用缺氧和常氧预处理的BMSCs来源外泌体均能够减轻I/R导致的大鼠心肌病理损伤、减小心肌梗死面积，且缺氧干预组减轻大鼠心肌I/R 损伤程度的作用优于常氧干预组，说明缺氧预处理增强了BMSCs 来源外泌体对大鼠心肌I/R损伤的治疗作用。

I/R 发生时缺血心肌细胞内线粒体产生的腺苷三磷酸（ATP）减少，导致Ca2+在线粒体内积聚，破坏了线粒体基本功能，从而引起细胞呼吸链功能发生障碍；同时由于心肌细胞内SOD 生成减少，使氧自由基生成积聚增多，最终导致ROS 不断生成。高水平氧化应激可通过氧化脂质和改变DNA、蛋白质结构来损伤细胞，抑制过度氧化应激也是改善I/R 组织损伤的重要机制和途径［17］。本研究结果显示，缺氧干预组和常氧干预组均能升高I/R 大鼠心肌组织中SOD、T-AOC 表达，降低MDA 表达，且缺氧干预组变化更明显；这提示缺氧预处理BMSCs 来源外泌体可更好地抑制I/R导致的氧化应激反应。

HIF-1α 被认为是在缺血事件期间调节组织细胞对缺氧反应的主要转录因子。在I/R 发生时，缺氧条件可诱导HIF-1α 活化，通过增加血管生成蛋白、抑制线粒体功能和将代谢从氧化途径转换为糖酵解途径，进而改善缺血区域组织的氧供应［18］。研究证实，HIF-1α 对心肌I/R 损伤具有抑制作用［19］。本研究结果显示，缺氧预处理BMSCs 来源外泌体HIF-1α mRNA 和蛋白表达均明显高于常氧预处理BMSCs 来源外泌体；这提示缺氧预处理诱导BMSCs来源外泌体减轻I/R 导致心肌损伤的相关机制可能与其升高HIF-1α表达有关。

综上所述，BMSCs 来源外泌体可减轻I/R 大鼠的心肌损伤，且低氧预处理能增强其对心肌的保护作用，其机制可能与诱导BMSCs 来源外泌体HIF-1α表达上调、减轻心肌组织氧化应激反应有关。因此，低氧预处理有可能成为增强BMSCs 来源外泌体功能的一个有效方法。