乳腺癌钙化与基因表达谱及临床特征的相关性研究

邵华，冯传波，王钟林，朱双九，郑新闻

（连云港市第二人民医院 甲乳外科，江苏 连云港）

0 引言

乳腺钼靶X线是乳腺癌的主要影像学检查方法，在术前筛查、肿瘤分期、疗效评估、监测复发等方面发挥重要作用[1]。钙化是钼靶X线检查中一个比较常见的现象，约有40%~50%的乳腺癌可呈现钼靶X线钙化[2]。近年来，放射基因组学在乳腺癌的应用成为一个热点，放射基因组学可以对乳腺癌病变特征进行量化，以便更好地区分良恶性病变和患者特征，从而实现更精确的成像和筛查，以指导针对性的治疗[3]。本文通过对乳腺癌患者手术新鲜标本进行全基因组测序，分析乳腺癌钼靶X线钙化与临床特征及基因表达谱之间的关系，以期将钙化检查与肿瘤的生物学行为相结合，间接提示肿瘤分子生物学行为，为乳腺癌患者治疗提供有效指导，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年12月至2019年12月我院收治的经病理确诊的乳腺癌患者100例，均为女性；年龄29~76岁，平均（53.01±13.33）岁。其中TNM分期Ⅰ期10例，Ⅱ期31例，Ⅲ期59例，其他临床资料详见表1。入组标准：（1）术前未经过化疗；（2）无远处转移；（3）有明确病理；（4）有术前乳腺钼靶X线检查及完整的临床资料。排除标准：（1）非侵袭性乳腺癌；（2）早期接受新辅助化疗者；（3）伴有除乳腺癌外其他恶性肿瘤；（4）伴随其他脏器的钙化。本研究经我院伦理委员会同意，所有患者或委托人均签署知情同意书。

1.2 术前乳腺钼靶X线检查

患者常规于术前行乳腺钼靶X线检查，采用Senographe 2000D全自动化乳腺摄影机行侧斜位（MLO）及轴位（CC）摄影。按照乳房影像报告和数据系统（BI-RADS分级）标准对患者的乳房X线影像特征进行评估，由两位医师独立评估患者级别并针对每个病例填写BI-RADS分类表：1：正常；2：良性；3：可能是良性；4A：低度可疑；4B：中度可疑；4C：高度可疑；5：高度提示为恶性病变。将患者分为3组，1和2作为无可疑钙化组，3、4A和4B作为疑似恶性钙化组，4C和5作为高度疑似恶性钙化组（分别简称为无可疑组、疑似组及恶性组）。

1.3 构建患者基因表达谱

术中收集患者的新鲜病理组织，用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA后，进行文库建库，并采用二代测序技术，检测全基因组表达谱。采用R语言软件包分析测序结果，对比3组检测结果中基因表达的差异，筛选出差异显著的基因（P<0.05），确定哪些差异基因可能与乳腺癌钙化形成相关，并筛选出相关性最大的靶基因。

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0做相关统计处理，三组患者临床特征之间差异的比较用行X列表χ2检验，计量资料用（±s）表示，三组中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表达的差异，用各样本测序归一化后再进行log2计算得出的信号值作为数值，分别进行各组的两两比较，采用完全随机设计两均数比较t检验，P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同种类钙化与乳腺癌临床病理特征之间的关系

100例乳腺癌患者经术前乳腺钼靶X线检查及钙化评估，具体分组为：无可疑组32例，疑似组35例，恶性组33例。对三组患者的临床病理特征如年龄、绝经情况、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移以及TNM分期进行比较，结果见表1。从表1可以看到，在年龄、绝经情况、肿瘤大小、组织学分级以及TNM分期等指标上，三组间没有显著性差异。而在淋巴结转移病例与无淋巴结转移病例之间，三组有显著性差异。这反映出钙化与淋巴结转移可能具有一定的内在联系。

表1 钙化与乳腺癌临床病理特征之间的关系[n(%)]

2.2 三组中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表达的相互比较

鉴于ER、PR、Ki67以及Her-2在乳腺癌分子分型中的重要性，我们从基因表达谱中，利用上述基因特异性探针检测各样本，归一化后再进行log2计算得出信号值。将各基因的三组数值进行两两比较，结果如下：ER、PR、Ki67的表达在三组中均无显著性差异，而Her-2的表达在无可疑组及疑似组中无显著性差异，但无可疑组与恶性组、恶性组与疑似组相比，差异均有统计学意义（P<0.05），具体见表2。

2.3 三组中基因组表达差异分析

我们将三组的基因组组成进行差异基因分析，共发现2462个基因在P<0.05的水平上有差异表达。其中，无可疑组与恶性组比较，共有差异基因1763个（上调912个，下调851个）；疑似组与恶性组比较，共有差异基因354信（上调216个，下调138个）；疑似组与恶性组比较，共有差异基因398信（上调242个，下调156个）。进一步分析无可疑组与恶性组差异基因，将两者差异基因按P值大小或差异倍数（Fold change）大小，选取排名前10基因，见表3和表4。从结果可以看出，在表3和表4中同时出现的仅有Her-2基因，且排名均靠前。提示Her-2基因在钙化分组中差异明显，这与表2结果一致。

表2 三组中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表达的相互比较（±s）

表2 三组中ER、PR、Ki67以及Her-2基因表达的相互比较（±s）

项目 无可疑组vs疑似组 无可疑组vs恶性组 疑似组vs钙化组ER 7.36±0.91vs7.75±0.94（P=0.095）7.36±0.91vs7.45±0.92（P=0.710）7.75±0.94vs7.45±0.92（P=0.189）PR 15.67±0.95vs15.30±1.03（P=0.135）15.67±0.95vs15.88±1.64（P=0.533）15.30±1.03vs 15.88±1.64（P=0.091）Ki67 3.97±1.19vs4.18±0.70（P=0.360）3.97±1.19vs4.00±0.62（P=0.874）4.18±0.70vs 4.00±0.62（P=0.265）Her-2 10.46±0.96vs 10.58±0.58（P=0.532）10.46±0.96vs11.76±0.99（P<0.05）10.58±0.58vs 11.76±0.99（P<0.05）

表3 按P值筛选的差异基因表达前10位基因

表4 按差异倍数筛选的差异基因表达前10位基因

3 讨论

乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤之一，美国肿瘤协会于2017年1月发布的数据显示乳腺癌十几年来一直是女性恶性肿瘤中发病率最高的疾病[4]。钙化是乳腺癌常见的影像学表现，有时甚至是临床乳腺癌检查能发现的唯一征象[5]；此外，钙化的检测和表型特征对乳腺癌患者术前评估病变范围和术后治疗效果检测具有重要提示作用[6]。在我们的研究中，利用患者基因表达谱分析钙化与基因表达之间的关系，我们发现Her-2在高度疑似钙化组中的表达较无疑似钙化组明显上调，揭示钙化有可能反映乳腺癌患者更具侵袭性。

一直以来，不断有研究试图阐明钙化的本质及其反映的分子生物学特性的内在含义。乳腺癌在发生发展过程中一种或多种相关基因的异常表达有重要作用，这些异常表达的基因可引起人体组织相对应的病理改变，从而反映出外在的诸如钙化等的影像学特征。因此乳腺癌的分子生物学、组织病理学及影像学特征间存在着一定的联系，随着放射基因组学的进步，根据影像学特征在分子水平阐述肿瘤组织病理学特征成为可能[7]。已有一些研究分析乳腺钼靶X线钙化分型与肿瘤组织学分型或分子标志物，如ER、PR和Her-2等之间的相关性，通过免疫组织化学结果分析显示，乳腺钼靶X线钙化常与侵袭性乳腺导管内原位癌（Ductal Carcinoma in Situ, DCIS）或Her-2阳性乳腺癌具有相关性[8-9]。但这些研究均基于免疫组化结果，于蛋白表达层面进行分析，缺乏对基因变化的深入分析。

随着二代测序技术的发展成熟，对不同病理分期特征的组织全基因组学检测成为研究热点。Ahmed等[10]分析了56名雌激素受体阳性乳腺癌患者的磁共振影像与基因表达谱之间的关系，提示乳腺癌磁共振显像有四种影像学表型，且与基因表达谱检测的复发可能性相关。筛选出的成像生物标志物有助于指导治疗决策。Lehmann和Prat等[11-12]应用基因表达谱对三阴性乳腺癌鉴定不同的分子特征，从而确定了相关亚群，对指导三阴性乳腺癌的治疗帮助巨大。目前，对有关钙化的分子生物学仍知之甚少，且对不同乳腺癌钼靶X线成像的全基因转录组学特征分析尚缺乏系统研究。我们的研究利用二代测序技术，提示乳腺癌的基因表达模式在有钙化或无钙化的患者之间有显著不同。高度可疑钙化的乳腺癌与HER-2基因表达密切相关。同时，我们发现钙化与乳腺癌淋巴结转移亦密切相关。研究发现激活的HER-2基因通过促进分泌细胞基底膜降解酶、改变整合素和黏合素的功能、激活MAPK等多条途径，逃避微环境的监控，增强转移潜力。因此，Her-2阳性表明肿瘤容易侵袭扩散[13]。因此，与无钙化乳腺癌患者相比，钙化型乳腺癌可能具有较高的侵袭性和转移性。根据钙化预测乳腺癌的生物学行为可能有重要的临床意义。

诚然，我们的研究也存在一些局限性。首先，入组本研究的病例样本数较少。乳腺癌是一种异质性很强的恶性肿瘤，这就导致病例样本间基因表达谱有可能存在很大不同。我们的数据显示HER-2在钙化患者中表达上调，尚缺乏多中心或更大样本范围的验证。其次，对于基因谱中除了HER-2之外，排名靠前的其他基因在乳腺癌钙化中的作用，我们没有进一步讨论，有待于在今后的体内体外实验研究中深入分析。

综上所述，本研究根据患者乳腺钼靶X线钙化影像学特征进行分组，构建不同分级患者基因表达谱，为进一步阐述乳腺癌放射基因组学研究提供临床数据。研究证实，淋巴结转移病例与无淋巴结转移病例之间、Her-2表达上，无钙化及有高度疑似恶性钙化的患者间有显著性差异。有无钙化组间共有2462个基因表达差异。Her-2基因在高度疑似恶性钙化的乳腺癌中表达上调（4.833倍，P<0.05）。说明乳腺癌中的钙化与Her-2的mRNA过表达和淋巴结转移密切相关。这一结果有助于进一步理解乳腺癌的生物学特征，为乳腺癌的临床治疗提供指导。