IFITM2在胃癌组织中的表达及其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响

2021-08-18 01:48刘勇刚黄俊勇罗美华
中国医药科学 2021年13期
关键词:划痕孵育胃癌

刘勇刚 黄俊勇 李 曦 罗美华

南方医科大学顺德医院 (佛山市顺德区第一人民医院)肿瘤科,广东佛山 528300

胃癌是全球病死率最高的肿瘤之一。由于早期症状隐匿,大部分患者确诊时已属于中晚期,5年生存率低于20%[1]。肿瘤的局部复发和转移是胃癌患者预后差的主要因素之一[2],但确切的分子机制尚未清楚。

干扰素诱导跨膜蛋白家族(interferon-induced transmembrane proteins,IFITMs)共 有 4个 功 能性成员包括 IFITM1、IFITM2、IFITM3和 IFITM5,而IFITM4被证实是无功能的假基因[3]。目前,对于该家族的研究主要集中于抗病毒作用方面,其通过阻止病毒进入细胞内并抑制病毒在细胞内复制的作用[4-5]。研究发现,IFITMs中的IFITM1、IFITM3均可通过介导上皮-间质转化(epithelialmesenchymal transition,EMT)的过程促进胃癌细胞的迁移和侵袭[6-7]。但针对IFITM2在胃癌中的研究鲜见报道。本研究探讨IFITM2在胃癌组织中的表达情况及其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 病例资料 收集2012年1月至2015年1月我院收治的54例胃癌患者癌组织及对应的癌旁组织样本,其中男32例,女22例,平均年龄(50.67±7.35)岁,Ⅰ~Ⅱ期11例,Ⅲ~Ⅳ期43例。所有组织标本取出后即刻冷冻于液氮中,保存在-80℃环境中。所有入选患者术前均未接受相关治疗。患者术后总生存期时间为手术后至胃癌相关疾病死亡时间,所有患者术后随访5年。本研究获得南方医科大学顺德医院医学伦理委员会批准,并由每位患者签署知情同意书。

1.1.2 细胞及试剂 免疫组织化学试剂盒购自西宝生物科技(上海)股份有限公司,GES-1及MKN45购自中国科学院上海生物工程研究中心,胎牛血清、RPMI1640培养基、PBS缓冲液、苏木素购自美国Hycolon公司,6孔培养板购自上海广锐生物科技有限公司,Lipofectamine 3000转染试剂购自南京森贝伽生物科技有限公司,RNA提取试剂盒购自日本Takara公司,IFITM2、E-cadherin、Vimentin、GAPDH抗体购自美国CST公司,IFITM2沉默质粒购自上海吉玛基因公司。

1.2 方法

研究胃癌组织及细胞中IFITM2表达水平

1.2.1 免疫组化检测蛋白表达水平 组织切片按标准实验步骤操作,IFITM2一抗4℃冰箱孵育过夜,PBS清洗3次后,室温二抗孵育30 min,DAB显色,苏木素复染,脱水透明后进行封片、晾干分析。所有染色结果均由两位病理科医师单独评估判定。

1.2.2 细胞培养 在37℃、体积分数为5% CO2培养箱中,使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养,2~3 d进行一次传代。

1.2.3 细胞转染 取对数生长期细胞3 ml种植于6孔培养板中,培养12 h后采用Lipofeetmnine 3000将200 pmol siRNA转染至细胞内,6 h后更换新鲜培养基继续培养48 h,进行下一步实验。

1.2.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR)检测基因表达水平 按照试剂盒说明书操作,分别提取胃癌组织、细胞中总RNA,采用SYBR Green法进行real-time PCR反应,扩增反应条件设置为:在95℃预变性30 s,95℃ 5 s,60℃ 34 s,共进行40个循环。

1.2.5 蛋白印迹法(western blot)检测蛋白表达水平 将蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后转移至硝酸纤维素膜,5% BSA室温封闭1 h后加入一抗在4℃冰箱孵育过夜,室温下二抗孵育1 h,采用ECL发光显示实验结果。使用Image J软件计算目的蛋白的相对表达水平。

1.2.6 划痕实验检测细胞迁移能力 消化肿瘤细胞后平铺于6孔板中,转染24 h后进行划痕,加入含5%胎牛血清的RIPM 1640继续培养。划痕后0、48 h进行显微镜下拍照。通过测量残留划痕宽度的方法来计算划痕修复率。每组实验重复3次。

1.2.7 侵袭实验(transwell)检测细胞侵袭能力 将1.0×105个肿瘤细胞加入上室,同时加入200 μl不含胎牛血清的培养基,将400 μl含10%胎牛血清加入下室,放入培养箱中孵育48 h,进行细胞固定、染色,并计算细胞总数。每组实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以()表示,采用t检验,生存分析采用Kaplan-Meier和Log-rank检验。计数资料以[n(%)]表示,采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFITM2在胃癌组织及细胞中的表达水平

与癌旁组织相比,胃癌组织中IFITM2的表达水平明显升高,mRNA相对表达量分别(0.612±0.114)、(1.239±0.156)(t=-12.436,P=0.005),见图1A。与GES-1细胞相比(mRNA表达水平标准化为1后进行统计),MKN45中IFITM2 mRNA 的表达水平为(2.893±0.136)(t=-15.386,P=0.003),见图 1B。

图1 胃癌组织及细胞中IFITM2的表达水平

2.2 IFITM2的表达情况与胃癌患者临床病理特征及预后的关系

分析54例胃癌组织中IFITM2 mRNA的表达水平,将高于中位值定为高表达组,而低于或等于中位值定为低表达组。结果发现IFITM2的表达水平与TNM分期、浸润程度、淋巴结及远处转移相关(P< 0.05),与性别、年龄和肿瘤分化程度无关(P>0.05)。见表 1。

表1 IFITM2 mRNA的表达水平与胃癌患者临床病理特征的关系(n=54)

2.3 IFITM2与胃癌患者预后关系

通过Kaplan-Meier绘制生存曲线分析,低表达组5年总生存率为22%,高表达组为50%,结果表明高表达IFITM2与患者预后不良显著相关(χ2=8.166,P=0.0043),见图 2。

图2 胃癌患者IFITM2低、高表达组的生存曲线

2.4 沉默IFITM2表达对胃癌细胞MKN45迁移及侵袭的影响

与对照组相比(mRNA表达水平标准化为1后进行统计),siFIFTM2 mRNA(0.286±0.045)表达下调(t=-2.635,P=0.037),见图 3A;与对照组(1.203±0.048)相比,siFIFTM2蛋白(0.302±0.051)表达水平下调(t=-2.755,P=0.024),见图 3B。与对照组相比(迁移系数标准化为1后进行统计),siRNA-IFITM2组 中 迁 移 系 数(0.263±0.089)下 降(t=-2.916,P=0.034),见 图 3C;对 照 组 与siFIFTM2组侵袭的细胞数为(332.667±26.398)、(116.391±18.904)(t=-6.947,P=0.024),见图 3D。

图3 沉默IFITM2表达对MKN45迁移及侵袭的影响

2.5 沉默IFITM2后对MKN45细胞中 E-cadherin、Vimentin表达的影响

与对照组相比,siRNA-IFITM2组中E-cadherin mRAN(1.863±0.217)表达上调(t=-3.135,P=0.026),Vimentin的 相 对 表 达 水 平 为(0.289±0.0987)(t=3.644,P=0.018),见图 4A。对照组与 siRNAIFITM2组E-cadherin蛋白相对表达量分别为(0.813±0.108)、(1.307±0.116)(t=-2.635,P=0.038);对照组与siRNA-IFITM2组Vimentin蛋 白 相 对 表 达 量 分 别 为(0.736±0.114)、(0.326±0.098)(t=2.842,P=0.035),见图 4B。

图4 沉默IFITM2对MKN45中E-cadherin、Vimentin表达的影响

3 讨论

胃癌是我国高发病率和高病死率的消化道恶性肿瘤之一,大部分胃癌患者就诊时已处于局部晚期或出现远处转移[8]。近年来,虽然治疗胃癌的方法不断改善,但胃癌的病死率却仍然较高[9]。影响患者生存预后的主要因素表现在通过血管和淋巴管导致的远处转移[10],但其具体机制尚未完全明确。因此,寻找调控其侵袭和转移的关键分子,有望为临床改善胃癌患者预后提供新的治疗策略。

EMT过程涉及了E-cadherin、Vimentin等蛋白的参与,通过失去上皮样细胞的特性及获得间质样细胞的表型而促进肿瘤进展[11]。EMT改变了细胞原有的形态,并促使细胞与细胞基质间相互作用,调节细胞外基质,使细胞更具有侵袭性。另一方面,E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白的异常表达又可以促使肿瘤细胞的EMT趋势,降低细胞间相互联系,促进肿瘤细胞侵袭及转移[12]。研究发现IFITMs参与肿瘤的发生发展,并往往扮演促癌基因的角色,如Ogony等[13]发现在三阴性乳腺癌中STAT2/BRG1复合体通过发生相互作用,激活IFITM1表达,促进三阴性乳腺癌的侵袭表型;肺腺癌中,干扰IFITM3后肿瘤细胞的增殖、迁移能力受到抑制[14],Xu等[15]研究发现胰岛素生长因子通过胰岛素生长因子1受体/转录因子STAT3通路可以部分激活IFITM2表达;同时,激活的IFITM2又可以调节白细胞介素6的表达及分泌促进胃癌细胞的增殖。然而,目前针对IFITM2在胃癌中的研究极少报道。

本研究发现,IFITM2在胃癌组织及细胞中明显高表达(P<0.01),其表达水平与肿瘤TNM分期、浸润程度、淋巴结及远处转移情况显著相关(P<0.05)。通过Kaplan-Meier生存分析发现,高表达的IFITM2与胃癌患者的预后不良显著相关(P<0.01)。进一步通过划痕及Transwell实验分析siRNA-IFITM2组和对照组中细胞数量,发现沉默IFITM2的胃癌细胞迁移和侵袭的数目显著减少(P<0.05),表明沉默IFTM2的表达能显著抑制MKN45细胞的迁移和侵袭能力。并且发现沉默IFITM2后,E-cadherin的mRNA及蛋白的表达水平显著上调(P<0.05),Vimentin的mRNA及蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),提示IFITM2通过调控E-cadherin和Vimentin蛋白的表达水平,促进MKN45细胞的EMT进程,从而增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。

综上所述,IFITM2可能作为胃癌的促癌基因之一,有望成为其治疗的潜在靶点,具体机制有待于进一步的实验研究阐明。

猜你喜欢
划痕孵育胃癌
富马酸卢帕他定治疗皮肤划痕症的疗效观察
冰上芭蕾等
三物黄芩汤组分(群)配伍在大鼠肝微粒体孵育模型中的相互作用
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢
P53及Ki67在胃癌中的表达及其临床意义
精子与慢病毒孵育制备转基因猪的分子检测及遗传分析
胃癌组织中LKB1和VEGF-C的表达及其意义
胃癌组织中VEGF和ILK的表达及意义
光滑表面浅划痕对光反射特性