不同外源物质对三种柴胡种胚发育的影响

刘计权，王 宇，刘 昕，刘佳宁，王永辉*

(1. 山西中医药大学，山西 榆次 030619； 2. 北京中医药大学，北京 102488)

伞形科(Umbelliferae)柴胡属(Bupleurum)植物约有150种，我国分布有42 种、17 变种、7 变型[1]。2020版《中国药典》规定，中药柴胡来源于药用植物柴胡(BupleurumchinensisDC.)或狭叶柴胡(B.scorzonerifoliumWilld.)的根，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”[2]。药用植物黑柴胡(B.smithiiWolff)的根在华北、西北地区作柴胡药用，被收载于山西、甘肃等地方中药材标准中[3-5]。

野生柴胡主要分布于华北、东北、西北、山东等地，由于柴胡野生资源蕴藏量非常有限，目前商品柴胡主要来源于人工栽培。20世纪90年代初，山西、陕西、甘肃和河北等地开始人工种植柴胡。在柴胡规范化栽培中以种子进行繁殖，所以种子质量是影响柴胡产量和品质的重要因素。由于柴胡种子具有胚后熟的特性，新收获柴胡种子的种胚体积仅占胚腔的5.1%，尚处于休眠状态，需经过形态后熟过程才能发芽。而且柴胡种子极小，千粒重只有1 g左右，常温下贮藏的种子寿命不超过1年。这些因素导致柴胡播种后发芽率和出苗率极低、出苗不整齐现象，严重影响到柴胡栽培中的产量和质量[6]。

通过GA3、肌醇、烟酸三种不同外源物质处理三种柴胡种子，研究其对柴胡种胚发育的影响，以期加速柴胡种胚的发育、缩短后熟期、提高种子的发芽率，服务于柴胡的规范化种植。

1 材 料

供试种子：柴胡(B.chinensis)种子采自山西省绛县规范化种植基地2年生植株，狭叶柴胡(B.scorzonerifolium)种子采自山西省朔州市平鲁区野生植株，黑柴胡(B.smithii)种子采自山西省宁武县野生植株。2019年新采集的3种柴胡种子均经过鉴定，保存于4℃冰箱备用。

试剂：GA3(北京索莱宝科技有限公司)、肌醇(上海信裕生物科技有限公司)、烟酸(上海恒远生物科技有限公司)、无水乙醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

仪器：FA2014电子天平(北京中仪宇盛科技有限公司)、BA410生物显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)、HZC-250恒温培养箱(苏州市培英实验设备有限公司)、4号不锈钢手术刀柄(潮安县彩塘世纪顺兴发医疗器械)、22号手术刀片(扬州源康医疗器械有限公司)、5 cm×2.6 cm不锈钢双面刀片(上海吉列有限公司)。

2 方法

2.1 单因素试验

2.1.1 溶液配制

用电子天平分别称取GA3、肌醇和烟酸适量，用蒸馏水将其溶解，配制GA3(50、100、150、200、250 mg/L)、肌醇(25、50、75、100、125 mg/L)和烟酸(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L)系列浓度溶液，放置冰箱4℃保存。

2.1.2 供试种子处理

挑选饱满、大小、色泽一致的优质柴胡种子，用70%酒精溶液消毒30 s，消毒后用蒸馏水反复清洗种子3次，之后分别将种子浸泡在配制好的系列浓度溶液中，室温下浸泡24 h，蒸馏水做空白对照。

2.1.3 供试种子培养

取直径12 cm的干净培养皿，每个培养皿底部垫2层吸水纸，加入5 mL蒸馏水浸润吸水纸。将上述浸泡处理的柴胡种子均匀摆放至培养皿，每个培养皿摆放100粒种子，盖上盖子置于20℃培养箱进行无光培养，每处理重复4次。

在供试种子培养期间，每天查看培养皿中供试种子的情况，如有发霉种子及时进行清洗并更换吸水纸，每天中午定时添加1 mL蒸馏水以保持湿度。

2.1.4 种子胚率和发芽率测定

上述种子培养第20天测定种子胚率和发芽率。从每个培养皿中随机抽取10枚种子，从种子中间纵切、制片，在显微镜下测定种子的胚长、胚乳长，并计算胚率(胚率=胚长/胚乳长×100%)；培养结束后记录发芽种子数，并计算发芽率。

2.2 正交优化试验

通过单因素实验得到GA3、肌醇和烟酸浸种后促进柴胡种胚发育的最适宜浓度，在此基础上选用L9(34)正交表，以GA3(A)、肌醇(B)、烟酸(C)作为考察因素，按照体积比为1∶1∶1进行组合，对柴胡种子浸泡处理。以种子的胚率为指标，进行最佳组合考察，每个因素设3个水平。

3 结果

3.1 单因素试验结果

3.1.1 GA3处理对柴胡种子胚率的影响

GA3处理对柴胡种子胚率的测定结果见表1。随着GA3处理浓度的加大，柴胡种子的胚率呈现递增趋势，当处理浓度为200 mg/L时，种子胚率达到最大67.44%，当处理浓度为250 mg/L时，种子胚率出现下降。本试验中GA3为200 mg/L时是最适宜的处理浓度。

表1 GA3对柴胡种子胚率的影响Table 1 Effects of GA3 on embryo rates of B. chinensis seeds

3.1.2 肌醇处理对柴胡种子胚率的影响

肌醇处理对柴胡种子胚率的测定结果见表2。肌醇系列浓度处理柴胡种子后，种子胚率出现先增加后下降的趋势，其中本试验中处理浓度为75 mg/L时为最适宜浓度，种子胚率达到最大46.01%。

表2 肌醇对柴胡种子胚率的影响Table 2 Effects of inositol on embryo rate of B. chinensis seeds

3.1.3 烟酸处理对柴胡种子胚率的影响

烟酸处理对柴胡种子胚率的测定结果见表3。烟酸不同浓度对柴胡种胚发育有一定的促进作用，当烟酸浓度达到2.0 mg/L时，种子胚率达到最大48.17%，之后随着浓度增加种子胚率出现下降。本试验中烟酸浓度为2.0 mg/L时是最适宜浓度。

表3 烟酸对柴胡种子胚率的影响Table 3 Effects of nicotinic acid on embryo rate of B. chinensis seeds

3.2 正交试验结果

选用L9(34)正交表进行最佳组合考察，以GA3(A)、肌醇(B)、烟酸(C)作为考察因素，每个因素设3个水平，各因素水平表见表4。

表4 因素水平表Table 4 Factor level table

三种外源物质组合的正交试验结果见表5。由表中数值进行直观分析可以看出，各因素对柴胡种子胚率影响作用由大到小依次为GA3浓度>烟酸浓度>肌醇浓度，初步确定最佳的浓度组合为A2B3C3，即GA3浓度为200 mg/L、肌醇浓度为90 mg/L、烟酸浓度为2.25 mg/L。

表5 正交试验结果Table 5 Results of orthogonal test

为进一步明确各因素水平变化对试验结果是否具有显著影响，进行方差分析。表6方差分析结果显示，因素A和C的水平变化对试验结果有显著影响，故因素A和C确定为3水平；因素B对试验结果无显著影响，确定因素B为1水平。因此确定处理柴胡种子最佳浓度组合为A3B1D3，即GA3浓度为225 mg/L、肌醇浓度为60 mg/L、烟酸浓度为2.25 mg/L。

表6 正交试验方差分析表Table 6 Analysis of variance for orthogonal test

4 结果验证

为了验证最优浓度组合，采用正交试验优选出的最佳因素水平A3B1C3。按上述方法处理三种柴胡种子，以蒸馏水做对照，重复3次。三种柴胡种子胚率、发芽率测定结果见表7。与对照相比，GA3、肌醇、烟酸三种外源物质最优浓度组合能够明显促进三种柴胡种胚的发育，提高种子的发芽率，说明该结果用于柴胡种子的处理具有可行性。三种外源物质最优浓度组合对柴胡(B.chinensis)种胚的促进作用最大，对狭叶柴胡(B.scorzonerifolium)种胚的促进作用次之，对黑柴胡(B.smithii)种胚的促进作用最小，这可能与三种柴胡的生物学特性、种子来源不同有关。

表7 胚率和发芽率测定结果Table 7 Results of determination of embryo rate and germination rate

5 讨 论

柴胡种胚的发育先后要经过原胚、棒状胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和双子叶胚等几个阶段[7]。自然成熟期采收的柴胡种子的胚处于不同发育阶段，经石蜡切片研究发现，约20%左右的种胚处于球形胚，70%左右的种胚处于心形胚，10%左右的种胚发育到鱼雷胚，没有发现处于双子叶胚阶段的种胚[8]。自然成熟期的柴胡种胚存在严重的形态后熟现象，所以即使给予适宜的发芽条件也不可能萌发。

柴胡种子胚率是种子质量的重要指标，当种胚发育到一定阶段才具备发芽的能力。研究报道，当柴胡种子的胚长达到胚乳长的60%～70%时才能萌发[9]。新采收的柴胡种子常温存放5个月后种子胚率只能达到16.69%；当年生柴胡种子自然状态下存放到下一年春季播种，发芽率仅为30%～40%[10]。因此，生产上为提高柴胡种子发芽率和出苗率，一般需要对新采集的柴胡种子进行播种前处理。在土壤中层积处理能加速柴胡种胚的发育，促进种胚后熟，层积处理5个月，发芽率可达到50%～60%[6]。

GA3能够促进已分化芽的伸长生长；肌醇参与植物碳水化合物代谢，对组织快速生长有促进作用，对胚状体和芽的形成有良好影响；烟酸对植物的代谢过程和胚的发育有一定的促进作用[11]。本文研究结果可用于柴胡规范化种植中的种子处理，提高种子发芽率、出苗率和出苗整齐度。关于GA3、肌醇、烟酸三种外源物质组合对柴胡后期种苗生长、药材产量和品质形成的影响有待于进一步研究。