接种丛枝菌根真菌对木香无机元素吸收的影响

魏祖晨，赵顺鑫，李卓蔚，周 浓，黄小兰，郭冬琴，赵晶晶

(重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆 404120)

木香(AucklandialappaDecne)是菊科植物云木香和川木香的通称，又名蜜香、广木香、青木香。常以其根入药，具有健胃消胀以及行气止痛之功效，可治疗胸腹胀痛、停食积聚、呕吐泻痢等病症[1]。木香有效成分集中表现在其挥发油上，以最为丰富的木香烃内酯和去氢木香内酯作为主要活性成分，具有良好的消炎和抗肿瘤功效[2]。据考证，历史上木香来源复杂，其产地几经变迁，现主要集中于云贵川地区[3-4]。我国野生木香资源曾经十分丰富，但近些年由于木香激增的市场价值与市场需求，人们开始对木香进行疯狂的采挖砍伐，导致其野生资源几近枯竭。因此，寻找合适的木香人工育苗方法显得尤为重要，利用现代技术提高木香产量与品质亦成为了当前研究的重点[5-6]。

丛枝菌根(AM)真菌能与80%以上的高等植物根系形成良好的共生，改善宿主植物的矿质营养[7]，提高其适应性和抗逆能力[8]。有研究表明，接种AM真菌能增加西瓜土壤的肥力[9]。尤其在非生物胁迫作用情况下，AM真菌能使共生植株的生长发育得到明显改善[10]。另有学者研究发现，木香接种AM真菌能够促进其生长发育和生物活性成分的累积[11]。可见，AM真菌在维护植物健康，增强其抗病能力方面具有重要作用[12-13]。因此，AM真菌在中药材栽培方面具有广泛的应用前景。

近年来，不断有学者将AM真菌运用于经济植物的共生栽培中，如AM真菌能有效降低人工栽培滇重楼中重金属元素的含量[14]，并且能有效修复Cd和Pb复合污染的土壤，提高植物对重金属的耐受能力[15]。因此将AM真菌接种于木香，培育后测定其无机元素含量，探究AM真菌是否能在木香中发挥同样的作用，对木香今后的栽培地选择及品质优化提供了参考依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ME204E型万分之一分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；Speedwave Xpert型微波消解系统(北京利曼科技有限公司)；AFS-9750原子荧光光度计(北京海光仪器有限公司)；TAS-990AFG型原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

1.2 试剂

单元素标准溶液(1 000 μg/mL)：Cu(批号GSB 04-1725-2004)、Hg(批号GSB 04-1729-2004)、Mg(批号GSB 04-1735-2004)、Na(批号GSB 04-1738-2004)、Ca(批号GSB 04-1720-2004)、As(批号GSB 04-1714-2004)、Cr(批号GSB 04-1723-2004)、Zn(批号GSB 04-1761-2004)、Cd(批号GSB 04-1721-2004)、Mn(批号GSB 04-1736-2004)、P(批号GSB 04-1741-2004a)、K(批号GSB 04-1733-2004)、Pb(批号GSB 04-1742-2004)、Ni(批号GSB 04-1740-2004)、Cr(批号GSB 04-1723-2004a)均购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；硝酸、高氯酸、氢氟酸均为优级纯(国药集团化学试剂有限公司)；水为去离子水。木香对照药材(批号为120921-201309)购买于中国食品药品检定研究院，编为DZ组，见表1。

1.3 AM真菌

通过美利坚共和国国际丛枝菌根真菌种质资源保藏中心(INVAM)购得相应的AM真菌纯净菌剂，并经重庆三峡学院生物与食品工程学院郭冬琴副教授进行鉴定，作为本研究供试菌株，详细见表1。

表1 不同处理组及其接种AM真菌Table 1 Different treatment groups and inoculated AM fungi

1.4 木香种子

2012年10月，课题组在位于重庆市开县河堰镇的木香种植基地，选取株高、株型一致的健壮植株，采其成熟、新鲜的种子，并经重庆三峡学院周浓教授鉴定为菊科植物木香A.lappa。

1.5 接种处理及栽培管理

栽培容器为15 cm×18 cm的棕色塑料花盆(用酒精擦拭3遍后用)，栽培介质为园土和河沙按3∶1体积比混合制成，并过10目(2 mm)筛，在121℃灭菌2 h，每盆装土量为16.0 kg。试验地点为重庆市万州区铁峰山国家森林公园室内，试验时间为2013年2月～2014年12月。

试验共设置25个处理组，设24组AM真菌处理组(育苗时单一接种AM真菌)和CK(对照)组(幼苗生长过程中不接种AM真菌)，每处理组10个重复，每盆播种木香种子20粒，出苗后间苗5株。AM真菌菌土均匀施于木香种子(10%次氯酸钠溶液消毒15 min，清水冲洗干净)的表土下，接种剂量为每盆300个孢子(接菌体带有孢子、菌丝及侵染后根系的栽培基质)，同时播种紫云英(10%次氯酸钠溶液消毒15 min，清水冲洗干净)混合培养，待木香幼苗出土后除去紫云英植株。CK组不接种AM真菌，其他处理与处理组一致。将盆栽放置于室温(自然光照)下，定期观察与分析，按照木香的常规养护方法管理，每周浇1次Hoagland营养液。

1.6 样品采集与指标测定

1.6.1 样品

于2014年7月选择完整无损、长势优良并健康的木香根部洗净、烘干，按分析要求分别粉碎过筛(40目)，备用。

1.6.2 元素测定

木香样品中的N含量采用凯氏蒸馏法进行测定[16]，P含量采用钒钼黄比色法进行测定[17]。K、Ca、Mg、Na、Mn、Zn、Cu、Ni、Cd、Cr和Pb含量采用原子吸收分光光度法进行测定[18]，即称取木香0.200 0 g于消解管中，加入8 mL硝酸，在微波消解仪上进行消解(190℃，10 min)，消解完全后，冷却转移至25 mL容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度，空白样品同处理。Hg和As含量采用原子荧光分光光度计进行测定[19]，即称取木香样品0.200 0 g于消解管中，在微波消解仪上进行消解，消解完全后，Hg测定时，无需挥发掉酸，直接转移定容至25 mL测定；As测定时，加入5%硫脲、5%抗坏血酸和50%盐酸各2.5 mL，定容至25 mL后反应30 min。空白样品同处理。

1.7 数据分析

采用Microsoft Excel 2013进行数据的录入、整理，用 SPSS 19.0做方差分析，用Origin 9.1软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同AM真菌处理对木香大量元素含量的影响

24种AM真菌处理对木香大量元素的影响结果如表2所示，不同AM真菌处理对木香大量元素(N、P、K、Ca、Mg)含量的影响存在显著差异(P<0.05)。其中，24种真菌处理后的木香与CK组相比，60%以上的AM真菌处理组中N元素含量呈现升高趋势，其中Svi处理组含量最高为55.312 mg/g，是CK组的2倍以上，表明外源接种Svi处理组的AM真菌有利于木香根部对N元素的吸收；同时Gr、Sc、Ds、Sp、Afo、Asc、Rc、Rf、Ri这9个处理组N含量有所下降，最低的Rc处理组含量为13.271 mg/g，仅为CK组的50%左右，下降幅度较大。相反，60%的处理组中P元素含量出现下降现象，Po处理组含量为0.624 mg/g，与CK组相比，下降了80%左右；而Svi处理组对P元素的影响同N，提高到7.235 mg/g。同时，仅有25%的AM真菌处理组中K元素含量有所下降，其余处理组均呈上升趋势。Ds处理组含量最高，是CK组的3倍以上，达到27.009 mg/g，表明Ds处理组的AM真菌有利于木香根部对K元素的吸收。相反，80%的AM真菌处理组中，Ca元素含量都普遍呈下降趋势。其中最低的Ga处理组含量为0.070 mg/g，不足CK组的百分之一。同样，24个木香处理组中，80%以上的处理组中Mg元素含量呈现下降，最高Al处理组与最低Fm处理组含量相差达10 mg/g以上，这说明仅有少数AM真菌可以促进木香根部对Mg元素的吸收。从大量元素含量增长率来看，外源接种Gg、Rc和Al三个AM真菌可以显著促进木香根系对大量元素的吸收，而Svi、Asp和Pb处理的调控效果次之，其余处理对大量元素吸收的促进效果较差。

表2 不同AM真菌处理后木香根部大量元素含量Table 2 Contents of macronutrients in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/g)

2.2 不同AM真菌处理对木香微量元素含量的影响

24种AM真菌处理对木香微量元素的影响结果如表3所示，不同AM真菌处理对木香微量元素(Mn、Zn、Cr、Na、Ni)含量的影响存在显著差异(P<0.05)。其中，24种AM真菌处理后的木香与CK组相比，75%的AM真菌处理组中Mn含量呈现下降趋势，含量最高的Po处理组与最低的Fm处理组相差达50倍以上，这说明AM真菌处理后木香对Mn元素的吸收存在极显著差异。同时60%以上的AM真菌处理组中Zn元素含量也出现了下降趋势，但含量最高的Po处理组为0.527 mg/g，仅为CK的2倍，可见AM真菌处理前后，木香对Zn的吸收差异不大。相反，50%以上的AM真菌处理组中Cr元素含量都呈上升趋势，其中Gd处理组含量最高为0.110 mg/kg，表明Gd处理组AM真菌处理有利于Cr的吸收。然而，超过75%的处理组中Na元素含量出现了下降趋势，但Svi处理组含量最高为10.983 mg/g，是最低组的10倍，CK组的2倍，这说明AM真菌处理对木香吸收Na能力影响显著。同时75%的处理组中Ni元素含量出现下降趋势，但最高的Sp处理组含量达到54.492 mg/kg，远大于最低的Fm组和CK组，这说明AM真菌处理对木香吸收Ni元素能力影响极显著。从微量元素含量增长率来看，外源接种Gd、Ec、Po和Al四个AM真菌可以显著促进木香根系对微量元素的吸收，而Ga、Afo和Rc处理的调控效果次之，其余处理对微量元素吸收的促进效果较差。

表3 不同AM真菌处理后木香根部微量元素含量Table 3 Contents of trace elements in roots of A. lappa treated by different AM fungi (mg/kg)

2.3 不同AM真菌处理对木香有害元素含量的影响

24种AM真菌处理对木香有害元素的影响结果如表4所示，共检测了Cd、Cu、Hg、Pb、As五种有害元素。经处理分析，不同AM真菌处理对木香有害元素含量的影响存在显著差异(P<0.05)。其中，Hg、Cd检出率较低。参照WM/T2-2004《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》，即Pb≤ 5.0 mg/kg，Cd≤ 0.3 mg/kg，As≤ 2.0 mg/kg，Hg≤ 0.2 mg/kg，Cu≤ 20 mg/kg。检出的五种有害元素中，Ga、Svi、Po、DZ处理组中As出现超标，其余四种元素大大低于此标准。与CK处理组相比，大部分处理组有害元素含量呈现下降趋势，AM真菌处理能有效降低木香根部对有害元素的吸收。其中，Gm、Sc和Sp处理组的调控效果最佳，Ga、Gg、Sdi、Sd、Fm、Asc和Pb处理组的效果次之。

表4 不同AM真菌处理后木香根部有害元素含量Table 4 Contents of harmful elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi (mg/kg)

2.4 不同AM真菌处理木香元素间相关性分析

木香常以其根入药，本文测定样品为不同AM真菌处理组的木香根。利用SPSS对24组不同AM真菌处理木香根中的15种元素进行相关性分析，结果如表5所示，不同AM真菌处理后的木香部分元素间存在一定相关性。其中，有17对元素呈极显著正相关(P<0.01)，包括N-P、P-Hg、K-Mg，Ca与Mn、Pb、Cu、Zn，Na与Cr、As，Mn与Pb、Cu、Zn，Cr与As等，这说明木香部分元素间存在相互促进累积的作用。

表5 不同AM真菌处理后木香根部元素相关性分析Table 5 Correlation analysis of elements in roots of A. lappa treated with different AM fungi

3 讨 论

木香作为一种中药材，因其具有健胃消胀以及行气止痛之功效而受到了广泛的关注。AM真菌作为陆地生态系统广谱有益的微生物，可与80%以上的高等植物根系形成互惠的共生体[20]，因其能促进宿主的生长发育、增强其抗逆性，在中药材的培育中前景广阔。近年来，科研工作者对木香与AM真菌接种的研究也逐步深入，阳文武等[6]通过测定云木香幼苗的根系菌根侵染率、根生物量、生理生化特性及萜类成分积累等指标，发现美丽盾巨孢囊霉(Scutellosporacalospora，Sca)、易误巨孢囊霉(Gigasporadecipiens，Gd)、沙荒球囊霉(Septoglomusdeserticola，Sde)、瑚状盾巨囊霉(Racocetracoralloidea，Rco)、巴西类球囊霉(Paraglomusbrasilianum，Pb)和哥伦比亚内养囊霉(Entrophosporacolombiana，Ec)可以作为人工云木香栽培条件下的潜在优良菌株进行施用。微量元素与中药药效及药性的关系长期以来都受到人们的关注。中药中的微量元素进入人体后，有可能促进中药中某些药用成分发挥作用，并且某些微量元素本身就有疗效作用，如Na、K和Ca可以维持体内细胞的内外渗透平衡，维持神经细胞膜的生物兴奋性；Zn可以增强人体的免疫功能；Mn可以减少血管内血栓的形成，降低动脉硬化的危险；Mg是多种酶的辅基和激活剂[21]。本文将24种AM真菌接种于木香植株，探究其根部内各元素含量的变化情况，发现大部分处理组的木香根部内大量元素和微量元素含量远超过CK组，而有害元素含量则显著低于CK组，这证明外源接种AM真菌对木香根部无机元素的吸收起到了促进作用。根据木香根部对无机元素的吸收情况来看，Al、Rc、Ga、Gg和Pb处理组对木香根部无机元素吸收的调控效果最佳，在木香生产栽培上可以进行施用。

将这些无机元素用SPSS进行相关性分析发现，部分元素含量之间存在极显著或显著相关关系。AM真菌与植物根部形成的共生系统，增强了植物的富集能力，但不同真菌或不同植物之间的相互作用，最适条件仍值得继续探究。总体来看，接种AM真菌对木香无机元素吸收是存在影响的。这些影响既有拮抗作用又有协同作用。本研究为木香今后研究奠定了基础，为木香未来发展拓展了空间，也填补了AM真菌在中药材应用中的空白。