两款酶联免疫吸附试剂盒检测玉米呕吐毒素的性能评价

何咏怡，古汶玉，邓常继，汤敏儿，钟国才，陈 威*

（广东省粮食科学研究所,广州 510000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol）又称为呕吐毒素 （vomitoxin），主要是禾谷镰刀菌（Fusarium.graminearum）和黄色镰刀菌（Fusarium.culmorum）等真菌产生的次生代谢物，具有急性毒性、胃肠道毒性、肝毒性、免疫毒性、发育毒性、生殖毒性、神经毒性和核糖体毒性[1]。玉米是我国第一大粮食作物[2]，由于其基质是霉菌生长繁殖理想温床，玉米经常面临镰刀菌属等霉菌污染的风险[3]，Yan等最近发表调查结果显示2017年中国玉米样品中呕吐毒素的检出率甚至接近100%[4]。据此，为了及时制定预防和控制呕吐毒素污染策略和保障粮食安全提供支撑，定时筛查玉米中呕吐毒素含量十分必要。

目前呕吐毒素的检测方法主要基于免疫分析、色谱分析和质谱分析原理[5]。基于色谱和质谱分析的方法主要包括高效液相色谱法、气相色谱-串联质谱法和液相色谱-串联质谱法等，上述方法准确性高，但样品处理方法复杂且耗时、需要昂贵的仪器设备和专业的操作人员[6]。免疫学方法基于抗原和抗体反应，其中基于荧光极化免疫分析和化学发光酶免疫分析的方法检测灵敏度高，但检测结果稳定性差；利用胶体金免疫层析可在现场快速筛查，但其不能高通量检测[7-8]。与上述方法相比，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）具有灵敏度高、重复性和再现性佳、低成本和高通量的优点，是最常用的筛查方法[5,9]。随着国家粮食安全战略全面实施，将对呕吐毒素检测试剂盒质量提出更高的标准。为此，本文从灵敏度、基质效应、回收率、重复性和与仲裁方法一致性等方面，对比两款市售呕吐毒素ELISA试剂盒的检测性能，为试剂盒的选取和提高检测结果准确性提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

本试验选取玉米样品为黑龙江2019年产玉米。呕吐毒素标准品购于国家粮食和物资储备局科学研究院（编号：GBW(E)100304）。试验用水为超纯水，甲醇和乙腈为色谱纯（德国默克）。测评使用的两款国产呕吐毒素ELISA检测试剂盒生产批号 （生产批次）为 20200825和Z2J00G07。

1.2 仪器与设备

BLH-560K高速全自动锤式旋风磨 （浙江伯利恒仪器设备有限公司）；2-16PX离心机 （德国西格玛）；MixPlus涡旋震荡仪（合肥艾本森科学仪器有限公司）；Multiskan FC酶标仪 （赛默飞世尔科技公司）；1260高效液相色谱仪配备紫外检测器（安捷伦科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 ELISA检测玉米呕吐毒素含量

玉米中呕吐毒素ELISA检测的样品处理和检测方法按照试剂盒说明书严格执行。

样品处理方法：准确称取5±0.01 g粉碎样品于50 mL离心管中，加入25 mL超纯水，200 r/min下涡旋10 min，4 000 r/min离心5 min，收集上清液并以1:4比例使用超纯水稀释后用于检测呕吐毒素含量。

检测步骤：加入50 μL标准品或样本至微孔中，依次加入50 μL酶标物和抗试剂，25℃下避光反应15 min后，甩干板内液体，加入洗涤液洗涤4次。充分拍干孔内液体后，立即加入100 μL底物液，25℃下避光反应5 min后加入50 μL终止液，在酶标仪双波长（450/630 nm）模式下检测。

1.3.2 高效液相色谱法检测玉米呕吐毒素含量

参照《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》（GB 5009.111-2016）中的免疫亲和层析净化高效液相色谱法验证玉米样品呕吐毒素含量。液相色谱条件：C18柱（25cm×4.6 mm×5 μm），柱温 35 ℃，流动相为水-甲醇-乙腈（体积比为 70:15:15），流速为 0.8 mL/min，进样体积为50 μL，检测波长为218 nm。

2 结果与分析

2.1 检出限和定量限

利用两款试剂盒检测经液相色谱验证为阴性的玉米样品测定试剂盒检出限和定量限，试剂盒检出限为样本的检测平均值加上3倍标准偏差，定量限为样本的检测平均值加上10倍标准偏差，结果如表1。两款试剂盒说明书中标识检出限分别为200 μg/kg 和 250 μg/kg，GB 5009.111-2016 酶联免疫吸附筛查法中检出限和定量限分别为200 μg/kg和250 μg/kg，两款试剂盒的检出限和定量限等值见表1，其限量值小于说明书标识值和国家标准值，灵敏度均符合检测要求，且A试剂盒灵敏度更高。ELISA试剂盒的检出限一定程度上受样品基质的影响而改变[10]，这可能是玉米样品检测限低于说明书标识值原因之一。

表1 试剂盒A和试剂盒B的检出限和定量限 μg/kg

2.2 基质效应

试剂盒A检测含量相当于0、200、700、2 100和7 000 μg/kg的标准品；试剂盒B检测含量相当于0、250、750、2 250 和 6 750 μg/kg 的标准品；同时分别使用试剂盒A和试剂盒B检测阴性样品基质溶液配制的含量相当于 0、200、800、2 000 和 7 000μg/kg的基质标准品；以呕吐毒素浓度为横坐标，吸光值比值（B/B0）作为纵坐标，绘制两款试剂盒标准曲线和基质标准曲线（图1）并计算曲线IC50（表2）。

图1 两款呕吐毒素ELISA试剂盒测定的标准曲线和基质标准曲线

表2 两款呕吐毒素ELISA试剂盒IC50

由于样品中色素、淀粉、蛋白质和脂肪等物质可能会阻碍抗原和抗体结合，使免疫分析敏感性下降，最终影响检验的准确性[7]。两款试剂盒检测所获标准曲线和基质标准曲线几乎重叠（图1），标准曲线IC50和基质标准曲线IC50差异不大 （表2），表明在200～7 000 μg/kg浓度范围内两款试剂盒对玉米呕吐毒素的检测受基质干扰较少。此外，从图1可以看出试剂盒B的测量结果线性范围 （200～7 000 μg/kg）较试剂盒 A（200～2 100 μg/kg）广，选择试剂盒 B检测呕吐毒素含量大于2 100 μg/kg的玉米样品有助于获得更准确结果。

2.3 回收率

分别使用两款试剂盒检测含量相当于500和1800 μg/kg的阴性玉米基质的呕吐毒素加标样品，每个浓度重复3次，两款试剂盒加标回收率结果见表3，试剂盒A和试剂盒B的回收率分别为83.1%～92.4%和83.8%～107.4%，回收率的相对标准偏差在3.0%～3.4%和5.9%～8.3%。回收率可在一定程度上反映检测方法的准确性，一般要求回收率在70%～140%之间[11]，上述结果表明两款试剂盒均符合检测要求，且试剂盒B回收率更高。

表3 两款呕吐毒素ELISA回收率试验结果

2.4 重复性

分别使用两款试剂盒检测含量为500 μg/kg和3 352 μg/kg样品，每个样品重复3次，结果见表4，试剂盒A变异系数和相对标准偏差分别为4.1%～4.5%和7.0%～9.4%，试剂盒B变异系数和相对标准偏差分别为2.0%～3.2%和5.1%～7.4%。一般要求重复测量变异系数小于10%，GB 5009.111-2016规定两次ELISA试剂盒重复测量结果标准偏差不得超过25%，即两款试剂盒重复性符合国家标准要求。

表4 两款呕吐毒素ELISA试剂盒重复性结果

ELISA洗板可去除未结合的酶标物，同时消除非特异吸附的蛋白质等的干扰[6,11]，洗涤不充分可能导致吸光值升高。两款试剂盒检测流程的洗板过程的洗涤液添加量和洗板时间不同 （试剂盒A为250 μL洗涤液，洗涤间隔10 s；试剂盒 B为 300 μL洗涤液，洗涤间隔30 s）可能是B试剂盒重复性高于A试剂盒的原因之一。此外，样品提取液及ELISA试剂盒的酶标物和抗试剂溶液粘稠，反向取液不易产生气泡，采用反向取液加入上述试剂可减少相对误差，提高检测的重复性[12]。

2.5 与仲裁方法一致性

两款呕吐毒素ELISA试剂盒法和免疫亲和层析净化高效液相色谱法对10个玉米样品的检测结果见表5，试剂盒A和试剂盒B测定与液相测定值正确度范围分别在63.86%～104.90%和76.45%～117.55%；利用配对t检验法对两款试剂盒测定值与液相色谱法测定值的显著性分析获得tD分别为0.75（试剂盒A）和0.94（试剂盒B），两款试剂盒的tD小于t0.05,10（2.23），表明两款试剂盒测定值与液相色谱测定值间无显著性差异。

表5 两款呕吐毒素ELISA试剂盒和高效液相色谱法对玉米样品检测结果

以液相色谱法测定值作为横坐标，试剂盒测定值作为纵坐标绘制线性关系图（图2）,试剂盒A和试剂盒B回归直线相关系数分别为0.99068和0.98656，说明两款试剂盒测定值与液相色谱法测定值相关性良好。尽管上述结果表明两款试剂盒测定值与液相色谱法测定值一致性良好，但从单个样品测定值看，两款试剂盒存在假阴性检测结果（样品7和样品8），为减少误判，建议可对处于临界值样品多次检测，及进一步结合高效液相色谱法确定。

图2 两款呕吐毒素试剂盒和高效液相色谱法对玉米样品检测值相关性

3 结论

两款市售试剂盒测试均能够在30 min内完成10个以上样品的检测，检测灵敏度高，样品基质干扰少，回收率和重复性能满足检测要求，并且与高效液相色谱法检测值一致性良好。在使用ELISA试剂盒检测时，采用反向取液和充分洗板有助于提高检测重复性；为提高检测准确性，对于标准限量值附近检测值的样品建议进行多次重复测量和利用高效液相色谱法检测。