酶法提取杜仲叶活性成分的研究*

陈书明，陈 玮

（三门峡市生物技术重点实验室，三门峡职业技术学院，河南 三门峡 472000）

杜仲是我国特有树种[1]，2018年纳入药食两用物质管理，引发了新一轮的杜仲食用热潮。杜仲叶中含有大量的活性成分如杜仲胶、绿原酸等[2-5]，2005版中国药典将绿原酸定为评估杜仲品质的重要指标参数[6-7]。常规的提取方法因存在活性成分提取率低和有机物残留问题，导致用杜仲叶开发精纯性保健产品困难。随着人们养生意识的加强，精纯性保健品因其更好的功效将被越来越多的人选择。

本项目以杜仲叶为原料，粉碎后通过添加复合酶制剂来提高提取物中活性成分含量、减少杜仲叶提取物中的青气和酸涩味道，以期为杜仲叶活性成分精纯产品的商业化生产提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

杜仲叶，灵宝帅华牧业有限责任公司提供；绿原酸标准品，中国食品药品鉴定院产品；中性蛋白酶（酶活≥40万 U/g）、果胶酶（酶活≥120万 U/g）、纤维素酶（酶活≥1万U/g）、单宁酶（酶活≥10万 U/g），佳味源实业有限公司产品；其它化学试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 仪器与设备

LH-08B连续流粉碎机，长沙市中胜制药机械厂（湖南）；HA-4数显恒温水浴锅，江西金坛市荣华仪器制器有限公司；UV-1100紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；德国赛多利斯MA150型电子水分分析仪，上海右一仪器有限公司；HA-4数显恒温水浴锅，江西金坛市荣华仪器制器有限公司。

1.3 方法与步骤

1.3.1 提取工艺流程

杜仲叶→干燥→粉碎→酶解浸提→过滤去渣→测定活性成分含量

1.3.2 操作要点

（1）7月份采摘杜仲叶片，晾晒3～4 d后240℃杀青[8-9]。

（2）杀青处理后的杜仲叶片，粉碎机粉碎为粉末，然后过筛，根据粉末颗粒粗细分为六个等级，Ⅰ级为0～20目、Ⅱ级为20～40目、Ⅲ级为40～80目、Ⅳ级为80～120目、Ⅴ级为120～160目、Ⅵ级为160目以下。然后立即置于自封袋，在阴凉处遮光保存；

（3）以杜仲叶粉末质量计，纤维素酶、果胶酶、单宁酶、蛋白酶用量均设0.05%、0.10%、0.15%、0.20%4个梯度。制成杜仲叶与水质量比为1∶50的混合液，35℃、45℃、55℃水浴加热60 min，同时做3组平行试验。

（4）水浴后的样液加1.5倍沸水，趁热减压过滤。

（5）对滤液进行水浸出物含量测定和绿原酸含量测定。

1.3.3 水浸出物含量测定

参照GB/T 8305-2013《茶水浸出物测定》。

按以下公式计算茶水浸出物含量：

式中：m0为样品质量，单位为g；m1为干燥后茶渣质量，单位为g；ω为样品干物质含量 （质量分数），单位为%。

1.3.4 绿原酸含量测定[10-11]

绘制标准曲线 精密称取绿原酸标准品10 mg，用50 mL 95%乙醇溶解,转移到200 mL容瓶量，加95%乙醇定容, 混匀。 吸取 1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00 mL，分别置于 10 mL 容量瓶中，加95%乙醇到刻度，混均。330 nm处测定吸光度。以溶液的吸光度为纵坐标，绿原酸的浓度为横坐标做绿原酸标准曲线图。如图1所示。

图1 绿原酸的标准曲线图

线性回归得到计算公式为：y=0.496x（y为吸光度，x 为浓度）R2=0.999。

1.3.5 含水量测定

按照MA150型电子水分分析仪要求，把不同粉碎粒度的杜仲叶样品分别铺平放进水分分析仪样品盘中，当显示器中的质量数值恒定时停止处理，记录数据，并绘制样品不同含水量图（见图2）。

图2 粉碎度对粉末含水量的影响

1.3.6 叶绿素含量测定

分别取各级杜仲叶粉末各2 g加乙醇20 mL，搅拌均匀，用乙醇冲洗玻璃棒，避光静置30 min。过滤，用滴管吸取乙醇，冲洗滤纸及滤渣，直至无绿色为止，然后用棕色容量瓶定容至100 mL，摇匀。取叶绿素提取液在波长665 nm、645 nm和625 nm处测其吸光度，以95%乙醇作为空白对照。记录数据，计算公式为:

根据叶绿素含量绘制样品粒度与叶绿素含量图（见图3）。

图3 粉碎度对水浸出物含量的影响

1.4 正交试验设计

在单因素试验之后，将蛋白酶用量（A）、果胶酶用量（B）、纤维素酶用量（C）、单宁酶用量（D）作为考察因素，以绿原酸浸出量为考察值，设计L9（34）正交设计试验，正交设计因素和水平见表1，得到复合酶提取杜仲叶活性成分的最佳配比。

表1 正交试验因素和水平 %

2 结果

2.1 杜仲叶片粉碎度对其营养成分的影响

2.1.1 粉碎度对粉末形态及含水量的影响

通过观察，发现在Ⅰ级粉末中能见到大量杜仲胶，粉末之间由杜仲胶粘连在一起，在Ⅱ级粉末中能见到少量杜仲胶与粉末粘连现象，其他的粉末均无粘连现象；叶片的梗相对于叶片质地较硬，粉碎后一般为1～2 mm的小段存留在Ⅰ级中粉末中。

由图2可知，样品粉碎级别与含水量成负相关。粉碎度越大，其含水量越低。因此可推测干燥后的整片杜仲叶含水量可能大于10%。一般绿茶含水量超过8%就会霉变，杜仲叶含水量超过10%仍然不会变质，这可能是可能由于杜仲的某种特定成分使然，也可能由于其内含物质非常丰富，结合水含量多，自由水含量少，水活度低，当水活度小于0.6时，霉菌、细菌、酵母菌、乳酸菌等无法成活。

2.1.2 粉碎度对水浸出物含量的影响

图3显示，叶片粉碎度与水浸出含量之间呈“W”型，Ⅲ级粉碎度时水浸出物含量最大，此级对应的是40～80目。Ⅳ级、Ⅵ级粉碎度和Ⅲ级差异不大，但是研究过程中发现粉碎度越大，过滤难度越大，操作误差越大。另外，因为水浸出物含量越高，杜仲速溶茶产率越高，因此，最佳粉碎度为40～80目。

2.1.3 粉碎度对浊度的影响

杜仲叶中含有一定量的蛋白质、单宁酸果胶物质和多酚等成分，它们与水中的钙、镁、铁等结合会形成混浊物和沉淀物，从而影响杜仲叶浸出液的浊度。杜仲叶浸出液中所含的这类物质提取时浸出量越大其浊度值越大。

由图4可知，85℃条件下，随着粉碎度增加浊度呈先降低、后升高的趋势，Ⅵ级粉碎度时浊度最高；55℃条件下呈先降低、后升高、再降低的趋势，Ⅴ级浊度最大；25℃条件下呈先降低、后升高、再保持不变的趋势，Ⅲ级粉碎度的浊度最大。除Ⅵ级外，55℃时浊度值大于同级别的25℃和85℃。由图4可知，就浊度而言最佳的粉碎度Ⅴ级，最佳温度55℃。在55℃下，会导致蛋白质的变性引起酶制剂的失活，因此，生产中如果添加酶制剂，需要适当降低温度。

图4 粉碎度与浊度之间的关系

2.1.4 粉碎度对叶绿素含量的影响

由图5可知，随着叶片粉碎度的增加叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素呈上升趋势。Ⅵ级时叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素最大。因为叶绿素是形成绿茶色泽的重要成分，因此其浸出量越多越好。然而它是一种很不稳定的物质，在光和热的条件下易分解，失绿而变褐，形成脱镁叶绿素。因此，提取过程中要考虑提取温度。

图5 叶片粉碎度与叶绿素含量之间的关系

研究过程中也发现，当提取温度分别为35℃、45℃、55℃时，55℃条件下，提取液能保持色泽较好的绿色，这可能是因为在该温度下能使茶汤变色的酶失活导致的。因为在绿茶中，茶多酚的保留量较多，其易被多酚氧化酶氧化，生成醌类化合物，导致色泽变褐。

2.1.5 粉碎度对绿原酸含量的影响

图6显示，随着叶片粉碎度的增加绿原酸含量呈先上升、后降低、再上升趋势。Ⅵ级时绿原酸含量最大。因此对于浸提绿原酸而言，Ⅵ级粉碎度是其最佳粉碎度。

图6 叶片粉碎度与绿原酸含量之间的关系

2.2 酶制剂对绿原酸浸出量的影响

2.2.1 蛋白酶对绿原酸浸出量的影响

图7显示，35℃条件下，随蛋白酶添加量增加绿原酸浸出量呈先升高、后保持不变的趋势；45℃条件下呈逐渐上升趋势；55℃条件下呈先升高、后降低趋势，添加量为0.05%时浸出量最高，为37.04 mg/g。除0.05%添加量外，蛋白酶添加量相同时，酶解温度越高，绿原酸浸出量越低，这可能是高温破坏了浸出的绿原酸。由图7可知，当蛋白酶的最佳使用条件是温度45℃，添加量0.20%。

图7 蛋白酶对绿原酸浸出量的影响

2.2.2 单宁酶对绿原酸浸出量的影响

图8显示，35℃、45℃、55℃条件下，与对照组相比添加单宁酶能有效提高绿原酸浸出量，但是各添加量的改变对绿原酸浸出量的影响不明显。由图8可知，单宁酶最佳使用条件为温度35℃，添加量为0.05%。

图8 单宁酶对绿原酸浸出量的影响

2.2.3 纤维素酶对绿原酸浸出量的影响

图9显示，35℃酶解温度下，绿原酸浸出量随着纤维素酶添加量增加呈逐渐升高趋势，添加量为0.20%时浸出量为37.49 mg/g，与对照相比，处理组高于对照组。45℃酶解温度下，绿原酸浸出量随着纤维素酶添加量增加呈先升高、后降低趋势，55℃酶解温度下，处理组绿原酸浸出量随着纤维素酶添加量增加呈逐渐降低趋势，均低于对照。除对照组外，同等酶添加量下各处理组绿原酸浸出量随温度升高而降低。由图9可知，纤维素酶最佳使用条件为温度35℃，添加量0.20%。

图9 纤维素酶对绿原酸浸出量的影响

2.2.4 果胶酶对绿原酸浸出量的影响

由图10可知，35℃、45℃和55℃酶解温度下，绿原酸浸出量随着果胶酶添加量增加呈先升高、后降低趋势，添加量为0.05%时浸出量最高。除0.05%外，同等果胶酶添加量下温度越高绿原酸浸出量越低。由图10可知，45℃时0.05%果胶酶添加量绿原酸浸出量最多，为32.16 mg/g。因此，果胶酶最佳使用条件为温度45℃，添加量0.05%。

图10 果胶酶对绿原酸浸出量的影响

2.2.5 复合酶制剂对绿原酸含量的影响

在单因素试验结果基础上，进行正交试验。因为酶制剂间存在相互促进作用，正交试验时酶制剂的添加量不高于单因素时的最佳添加量，试验设计和试验结果见表2。

表2 正交试验结果

根据表2的极差分析结果可知，复合酶制剂对杜仲叶提取效果的因素主次排序为：A＞C＞D＞B，即蛋白酶＞纤维素酶＞单宁酶＞果胶酶，其最佳试验方案是A2B2C3D3。试验过程中发现，使用复合酶制剂处理时，酶解后过滤难度比单一酶制剂（除果胶酶外）略大。

按照蛋白酶0.18%、果胶酶0.03%，纤维素酶0.20%、单宁酶0.05%进行验证试验，杜仲叶绿原酸浸出量为41.28 mg/g，是对照组的1.69倍，说明该复合酶制剂能提高杜仲叶中绿原酸的提取率。

3 结论

（1）粉碎度对杜仲叶各成分的影响。研究发现，对水浸出物而言最佳的粉碎度为40～80目，对浊度而言55℃Ⅴ级浊度最大，Ⅵ级时叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素最大，Ⅲ级粉碎度是黄酮的最佳粉碎度，对绿原酸而言Ⅵ级粉碎度是其最佳粉碎度。随着粉碎度的增加，浸提时的操作难度逐渐增加，操作误差增大，因此确定杜仲叶的最佳粉碎度为40～80目。

（2）酶制剂对绿原酸含量的影响。在单因素试验基础上进行正交试验，试验表明复合酶制剂对杜仲叶提取效果的因素主次排序为：蛋白酶＞纤维素酶＞单宁酶＞果胶酶，其最佳试验方案是A2B2C3D3。按照蛋白酶0.18%、果胶酶0.03%，纤维素酶0.20%、单宁酶0.05%进行试验，杜仲叶绿原酸浸出量为41.28mg/g，是对照组的1.69倍，说明该复合酶制剂能提高杜仲叶中绿原酸的提取率，并且过滤难度不大，能较好地适应企业生产。复合酶处理后的杜仲叶提取液位黄绿色，有杜仲叶特有的清香味、无青味，口感柔和且无涩味，符合人们对饮品的要求。