黑小米中角鲨烯的提取与测定

王克辉，袁彩霞，王璐，何海宁，李蕊岑，洪霞

1.甘肃中商食品质量检验检测有限公司（兰州 730010）；2.甘肃省商业科技研究所有限公司（兰州 730010）

角鲨烯为无色或微黄色透明油状液体，具有令人愉快的气味，吸氧变黏，成亚麻油状液体[1-2]。角鲨烯早先在日本作为治疗疾病的药物，如肺结核、脑膜结核、淋巴结核、骨结核疾病等[3-4]。研究发现，角鲨烯对抗疲劳、肺心病、防止慢性支气管炎、改善心功能及调节体内某些生化活动等具有非常重要作用[5-6]。角鲨烯的活性较高、易氧化，使得很多人对长期食用角鲨烯会不会对人体产生毒副作用产生疑问[7-8]。为此，饶丽晶等[9]对角鲨烯进行了白鼠亚急性毒性研究，试验剂量以成人日摄入量的100倍为最高剂量，对整个试验组动物灌喂30 d后发现，动物体重无较大变化，肝脏等脏器系数、食物利用率和试验组类似血常规、血生化指标与对照组有显著差异，但均在正常范围之内[9]。由此得出结论，角鲨烯对机体没有毒副作用及不良影响，可以作为保健食品开发[10]。

不同产品中角鲨烯的提取与分离方法不同，常见的角鲨烯提取与分离的方法主要包括皂化分离法[11]、柱色谱分离法[12]、分子蒸馏法[13]、超临界提取法[14]、吸附分离法[15]、溶剂萃取法[16]等。其中最常用的是皂化分离法和分子蒸馏法。皂化分离法一次性去除脂肪酯和甘油酯效果明显，使角鲨烯含量明显提高，但此方法操作过程复杂，反应过程需大量低级醇，且在碱性条件下进行，对目的产物破坏性大[17-18]。分析蒸馏法特别适用于实验室分离，也易于工业化，利用该方法存在的缺点是成本较高，且对于原料中目的产物含量较低，提取效果不明显，需经预处理原料中的组分在超临界二氧化碳中溶解度较大，故分离效果不高，并且投资较大，操作费用较大[19-20]。

试验首次采用水解法提取黑小米中的油酯，利用气相色谱-质谱联用仪法确定油酯中的主要成分，确定小黑米油酯中含有角鲨烯。再将角鲨烯粗品通过硅胶柱色谱法进一步净化分离纯化，得到的角鲨烯通过气相色谱法进行定性分析研究。该方法操作过程简单，经硅胶柱净化分离后的角鲨烯与其他杂质峰得到很好的分离，消除了基质干扰，产品纯度高。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

角鲨烯标准物质（北京北方伟业计量技术研究院，99.8%）；石油醚（30～60 ℃，国药集团化学试剂有限公司，99.3%）；乙醚（国药集团化学试剂有限公司，99.3%）；丙酮（分析纯，99.6%，西安市永红化工原料公司）；正己烷（色谱纯，99.6%，西安市永红化工原料公司）；黑小米样品（来自兰州市华联超市同批生产的小黑米）；二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

XS 225A-SCS电子天平（安徽首衡称重科技有限公司）；GENIUS3涡旋振荡仪（无锡沃信科技有限公司）；移液管；吸耳球；CF16RXⅡ台式高速离心机（盐城市安信实验仪器有限公司）；SB-100B超声波清洗机（无锡沃信科技有限公司）；气相色谱仪（带有氢火焰离子化检测器，Agilent 7890B）；硅胶柱（国药集团化学试剂有限公司，为带活塞的砂芯玻璃层析柱（10 mm×250 mm），加3.0 g硅胶，顶端加0.5 cm无水硫酸钠）；恒温水浴锅（无锡沃信科技有限公司）；涡旋振荡器（无锡沃信科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 黑小米中油酯的提取

试验利用水解法提取黑小米中的油脂，通过气相色谱法-质谱联用仪法测定油酯组分的主要成分。

1.3.1.1 水解

称取2.0 g（精确至0.1 mg）均匀的样品置于100 mL具塞试管中，加入5 mL 95%乙醇和10 mL超重水，混匀，加入20 mL盐酸溶液，混匀。将试管放入70～80℃水浴中，水解50 min。每隔10 min振荡一下试管，确保在试管壁上的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出试管冷却至室温。

1.3.1.2 提取

水解后的样品，加入20 mL 95%乙醇，混匀，然后加入50 mL乙醚-石油醚混合溶液（1∶1，V/V），振摇5 min，静置10 min。用少量的乙醚-石油醚混合溶液冲洗具塞试管和塞子，将有机层转移到250 mL烧杯中。按照以上步骤重复提取水解液2次，将3次收集的有机层合并到250 mL烧杯中。放置于水浴锅上蒸发至干，得到样品提取物。

1.3.1.3 净化与分离

将上述样品提取液转移至50 mL小烧杯中，加入5 mL石油醚，混匀，倒入用石油醚活化后的硅胶柱中，然后重复2次用5 mL石油醚润洗烧杯，洗涤液一并倒入硅胶柱中，当石油醚液面与上端无水硫酸钠层相切时，加入20 mL石油醚，收集全部的35 mL洗脱液置于50 mL收集管中，用氮吹仪氮吹至干，随后用正己烷定容至1.0 mL，充分振摇，转移到进样小瓶，待测。

1.3.2 标准溶液的配制

准确称取50 mg角鲨烯标准品于50 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀，得到1.0 mg/mL角鲨烯标准储备液。

1.3.3 气相色谱法测定条件

色谱条件：检测器FID（氢火焰离子化检测器）；色谱柱：HP-5（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；柱温：125 ℃（1 min）→25 ℃/min→150 ℃（1 min）→8 ℃/min→240（6 min）；汽化温度：220 ℃；检测温度：250 ℃；氮气：3.5 mL/min；进样方式：不分流进样；进样量：1 μL。

2 结果与分析

2.1 水解时间的优化

试验考察了不同水解时间（10，20，30，40，50，60和70 min）对黑小米中角鲨烯提取含量的影响。如图1所示，随着水解时间的增大，角鲨烯的含量不断的增大，且在50 min后角鲨烯的含量保持不变，因此，试验选择50 min为最优水解时间。

图1 不同水解时间对黑小米中角鲨烯提取含量的影响

2.2 提取溶剂的优化

试验考察了不同溶剂（乙醚、石油醚、乙醚-石油醚2∶1、乙醚-石油醚1∶1、乙醚-石油醚1∶2，V/V）对黑小米中角鲨烯含量提取的影响，结果如图2所示。可以看出，用溶剂乙醚-石油醚（1∶1，V/V）提取后测定的角鲨烯含量最高。

图2 不同溶剂对黑小米中角鲨烯含量提取的影响

2.3 两种不同提取法的比较

称取6份样品，分别采用水解法和索氏抽提法两种方法对黑小米中油酯进行提取，并对其提取含量进行比较，结果如表1所示。可以看出，水解法提取的油脂含量高于索氏抽提法的，这说明小黑米中油酯主要是饱和烃类油脂[21-22]，因此试验选用水解法提取黑小米中油酯。

表1 水解法和索氏抽提法两种方法比较 单位：g/kg

2.4 净化效果

据文献报道，动植物油中角鲨烯测定方法主要为气相色谱法，其样品前处理方法是非油脂类样品（油脂类样品直接皂化-甲酯化）经水解，乙醚-石油醚混合液提取，皂化和甲酯化，正己烷萃取后直接进样的方法。由图3可以看出，过多的杂质峰对目标检测物角鲨烯的峰形产生干扰，此外直接进样的方式会对色谱柱造成一定程度的污染。为了改善角鲨烯的峰形、减少对色谱柱等的污染、提高仪器检测灵敏度，试验采用水解提法提取，硅胶柱净化分离小黑米中角鲨烯。由图4可见，经硅胶柱净化分离，角鲨烯获得基线分离，消除杂质峰干扰，大大提高了检测灵敏度。

图3 黑小米中角鲨烯净化前色谱图

图4 黑小米中角鲨烯净化后色谱图

2.5 回收率和精密度

黑小米中角鲨烯含量较少，因此选择它作为加标回收试验的样品。样品的添加量分别为5.00，10.00和50.00 mg/kg，每一添加水平的样品数为6个，样品处理按1.3.1方法进行。先测定样品中角鲨烯的本底含量，再分别测定加标样品中角鲨烯的含量，扣除空白值后，计算加标回收率，加标样品的回收率及精密度结果见表1。由表1可见，平均添加回收率为91.8%～96.3%，相对标准偏差（SRSD）＜5.6%（n=6）。

表2 加标样品的回收率及精密度

2.6 标准曲线

取适量1.0 mg/mL角鲨烯标准储备液，用正己烷配制系列标准工作溶液，质量浓度分别为0.20，1.00，5.00，10.00，25.00，50.00和100.00 μg/mL。按选定的气相色谱条件，取1 μL进样，以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，结果表明，在上述浓度范围内呈良好线性，如图5所示，回归方程为Y=1.10704666X-0.1191426，线性相关系数（R2）为0.99992。

图5 不同浓度角鲨烯线性关系图

2.7 实际样品分析

试验对常见的4种小米样品中的角鲨烯含量进行了分析，各样品中角鲨烯含量见表3。由表可以看出，小黑米中的角鲨烯含量明显高于其他小米，是植物性角鲨烯的良好来源。

表3 市售的6种不同品牌小米样品角鲨烯含量的测定

3 结论

试验建立水解法提取，硅胶柱净化分离，气相色谱测定小黑米中角鲨烯的方法。样品提取后经硅胶柱净化分离，样品回收率高、净化效果好，减少了对色谱柱的污染，角鲨烯达到基线分离，避免了干扰组分对被测物峰的影响，大大提高了检测灵敏度，较文献方法灵敏、可靠，故该方法也可以用于其他实际样品中角鲨烯的分析。