UPLC-MS/MS法测定番茄酱中5种链格孢霉毒素

王远 ，邢丽杰 ，李先义，罗瑞峰，刘玉晗

1.新疆农垦科学院（石河子 832000）；2.石河子大学食品学院（石河子 832000）

番茄酱是生活中必不可少的调味品之一，它能大大提高食品的美味。新疆是生产番茄酱的主要产地，产量占全国的90%以上，并且出口总量达100多万 t。链格孢菌是一种广泛分布在蔬菜上的腐生、内生和致病性菌株，其在低温、潮湿的环境下生长繁殖，是导致蔬菜腐烂变质的主要微生物[1]。链格孢菌可产生70多种有毒代谢产物，统称为链格孢霉毒素[2-3]，其具有细胞毒性、基因毒性以及急性毒性，会对人体健康产生危害[4-5]。Sanzani等[6]对意大利南部阿普利亚地区的新鲜和干燥番茄样品进行了链格孢毒素检测，结果表明新鲜和干燥的番茄中均存在细交链格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TEA），且干番茄受污染程度高于新鲜番茄。Puntscher等[7]对奥地利的番茄酱进行检测，结果表明番茄酱中含有链格孢酚（alternariol，AOH）、交链格孢酚单甲醚（alternariol monomethylether，AME）、细交链孢菌酮酸（TEA）和腾毒素（tentoxin，TEN）。目前从食物中检出的链格孢菌毒素主要有腾毒素（TEN）、链格孢霉素（alternaria，ALT）、交链格孢酚单甲醚（AME）、链格孢酚（AOH）以及细交链格孢菌酮酸（TEA）。

我国尚未针对番茄酱建立链格孢霉毒素的限量标准和检测方法。现有文献资料报道的链格孢霉毒素的定量方法主要有气相色谱-串联质谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]和液相色谱-串联质谱法[11-13]。其中气相色谱-串联质谱法前处理需要进行衍生化处理，过程复杂。高效液相色谱法分离速度快，但是抗干扰差，存在一定假阳性。液相色谱-串联质谱法具有准确度高、灵敏度高、稳定性好等特点，成为复杂食品分析的主要方法。近年来QuEChERS前处理净化技术以其快速、溶剂使用量少和操作简单等特点被广泛应用于复杂样品的前处理[14-15]。试验以番茄酱为基质，研究QuEChERS方法中不同净化剂的净化效果，建立番茄酱中链格孢霉毒素的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定方法，为番茄酱中链格孢霉毒素的检测提供技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲酸、乙腈、甲醇（HPLC纯，德国CNW公司）；C18吸附剂、PSA吸附剂、GCB吸附剂、无水硫酸镁、氯化钠（德国CNW公司）；腾毒素（TEN）、链格孢霉素（ALT）、链格孢酚甲基乙醚（AME）、链格孢酚（AOH）、细交链格孢菌酮酸（TEA）5种ATs标准品（纯度均大于99%，德国Dr公司）。

1.2 仪器与设备

Waters XEVO TQ-S超高效液相色谱-串联质谱仪（美国Waters公司）；Sigma 3-30k型离心机（德国Sigma公司）；MS3-basic型漩涡混合器（德国IKA公司）；N-EVAPTM112型氮吹仪（美国Organomation公司）；KQ-600DE型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器公司）；ULPHW-IV型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）。

1.3 仪器参数

色谱条件：BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；流速为0.4 mL/min；梯度洗脱：0～0.5 min，95%（A）；0.51～5 min，95%～5%（A）；5.01 min，95%（A）；柱温30 ℃；进样体积5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正离子和多反应监测（MRM）模式，离子源温度为150 ℃，脱溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流速为50 L/h，氩气作为碰撞气。5种链格孢菌毒素在多反应监测模式下质谱参数见表1。

表1 多反应监测离子对及质谱条件

1.4 样品处理

准确称取5.00 g番茄酱样品于50 mL离心管中，向离心管中分别加入2 mL水和10 mL乙腈，涡旋混匀，超声提取20 min；然后加入1 g NaCl充分振摇，使其NaCl完全溶解后（使水相与乙腈相分层），以10000 r/min高速离心5 min。准确移取2 mL上清液于预先盛有0.5 g MgSO4和100 mg C18吸附剂的10 mL离心管中，涡旋混匀，在5000 r/min下离心3 min，取1 mL净化液在40 ℃下氮吹干，用1 mL乙腈水（体积比，1+1）溶液定容，过0.22 μm有机滤膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.5 线性范围及检出限

链格孢菌毒素单标储备液的配制：准确称取每种链格孢菌毒素的单个标准品，用乙腈溶解配制成质量浓度为1 mg/mL的溶液（-20 ℃保存）。

5种链格孢菌毒素混合标准溶液的配制：分别准确量取适量5种链格孢菌毒素标准储备液，用50%乙腈水溶液逐步稀释成0.5，1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列标准混合工作液。按照1.3小节确定的仪器参数进行测定，以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性拟合，分别得到5种链格孢菌毒素的线性方程和相关系数。同时分别计算3倍和10倍信噪比所对应的浓度，作为方法的检出限和定量限。

1.6 准确度及精密度

为了考察方法的准确度和精密度，选取2个阴性番茄酱样品进行加标回收试验，进行低、中、高3个水平的添加试验，每个添加水平连续重复测定6次。按照1.4小节的方法进行样品前处理，在1.3小节确定的色谱和质谱条件下测定，计算加标样品的回收率和相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 色谱-质谱分析2.1.1 质谱参数的优化

分别配制质量浓度为1 μg/mL的5种链格孢菌毒素单个标准溶液，采用intellistart和手动优化结合的方法，对每种链格孢菌毒素的离子模式（正/负）、母离子（锥孔电压）、子离子（碰撞能量）等参数进行选择优化，得到腾毒素、链格孢霉素、交链格孢酚单甲醚、链格孢酚及细交链格孢菌酮酸的最佳质谱参数（见表1）。

2.1.2 分离条件的选择

研究比较了不同有机相（甲醇和乙腈）与水相（添加甲酸）体系组成对5种链格孢菌毒素信号强度和分离效果的影响。结果发现，在水相流动相中加入甲酸（0.05%，体积分数）能有效地改善峰形，同时加入甲酸体系TEA的响应良好。而在没有添加甲酸的流动相体系中TEA不出峰，这可能是由于甲酸的加入更有利于TEA的离子化。同时在甲酸水-乙腈流动相体系中5种链格孢菌毒素的信号强度高于甲酸水-甲醇流动相体系，且色谱系统的整体压力较低。因此选择甲酸水-乙腈体系作为测定选定5种链格孢菌毒素的流动相。进一步比较了水体系中不同甲酸添加量（0.05%，0.1%，0.2%，0.5%和1%）对5种链格孢菌毒素信号强度的影响。结果发现，5种链格孢菌毒素在0.1%甲酸水-乙腈流动相体系中回收率高于其他流动相体系（见图1），故试验选取0.1%甲酸水-乙腈体系作为分离5种链格孢菌毒素的流动相。

图1 不同流动体系下5种链格孢菌毒素的比较

2.2 提取条件的选择

研究结合文献资料报道[1]选取乙腈作为提取溶剂，同时考察了乙腈中添加不同体积分数甲酸（0，0.5%，1%，1.5%和2%）对提取效率的影响，结果如图2所示。纯乙腈作为提取溶剂对5种ATs的提取效率最高，尤其是TEA。这与其他文献报道的甲酸乙腈作为提取溶剂不一致，造成这一结果的原因可能是番茄酱本身在制作过程中呈酸甜味，本身已经具备酸性条件，所以乙腈直接作为提取溶剂对5种ATs的提取效率较高，并高于其他添加甲酸的提取溶剂。因此，试验最终选取纯乙腈作为最佳提取溶剂。

图2 不同提取溶剂下5种链格孢菌毒素的提取效率

2.3 净化

研究考察了MgSO4、C18、PSA和GCB净化吸附剂对番茄酱中5种ATs提取液的净化效果。取2 mL待净化液加入到预先分别装有MgSO4（0.5 g）、C18（100 mg）、PSA（100 mg）和GCB（100 mg）的10 mL离心管中，同时加入10 ng ATs混合标样，在优化的试验条件下进行分析测定，结果如图3所示。MgSO4、C18和PSA的净化效果明显好于GCB的净化效果，GCB对5种ATs具有一定的吸附作用，尤其是对AME和AOH组分，几乎全部吸附。同时由图3可以看出，PSA吸附剂对AOH的影响较大，回收率低于70%，而MgSO4和C18吸附剂对5种ATs的净化效果好，回收率均超过80%。因此，试验选取0.5 g MgSO4和100 mg C18混合吸附剂作为净化吸附剂。

2.4 线性相关性

在上述仪器条件下进行测定，采用外标法定量，以MS/MS定量离子色谱峰面积（y）对质量浓度（x）绘制标准曲线，并求出相应的线性回归方程及相关系数。由表2可知，5种链格孢菌毒素在0.5～200 ng/mL质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数R2均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比计算，5种链格孢菌毒素的检出限均为1 μg/kg，定量限均为2.5 μg/kg。

表2 5种链格孢菌毒素的保留时间、线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 方法的准确度和精密度

按照1.6小节进行准确度和精密度试验，计算加标回收率和相对标准偏差，结果如表3所示。由表3中回收率和SRSD数据可以看出，选取的2个阴性番茄酱样品在3个添加水平下5种链格孢菌毒素的回收率在78.3%～104.8%之间，相对标准偏差在1.2%～7.4%之间，结果表明该方法测定分析的结果准确、可靠。同时该方法将保留时间和化合物碎片信息结合，进一步对化合物进行定性，这大大降低了检测结果出现假阳性或假阴性的可能。

表3 5种链格孢菌毒素的准确度和精密度试验结果（n=6）

2.6 实际样品的测定

利用建立的方法对采自新疆石河子市面上的20个番茄酱样品进行了5种链格孢菌毒素检测。图4分别是标准品（图4a）和实际样品（图4b）的提取离子质谱图。结果发现，在所有检测的番茄酱样品中，有部分样品检出TEA组分，质量分数在15～760 μg/kg之间。

图4 5种链格孢菌毒素标准品和实际样品的MRM图

3 结论

试验对液相条件、质谱条件、提取条件和净化条件进行了优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱测定番茄酱中腾毒素、链格孢霉素、交链格孢酚单甲醚、链格孢酚及细交链格孢菌酮酸的方法。该方法前处理简单，检测时间短，结果灵敏度高，整体线性关系、准确度和精密度良好。运用该方法对购于新疆石河子地区市面上的20个番茄酱样品进行测定，结果表明部分番茄酱样品中含有TEA组分，质量浓度在15～760 μg/kg之间。该方法的建立为检测番茄酱中链格孢菌毒素的检测提供检测依据，同时为检测其他水果酱等制品中链格孢菌毒素的检测提供技术参考。