不同酶澄清剂对麦芽-麦胚芽酒的澄清效果

王凯，黄钰，陈禹锜，伍雅励，赵文梅，李楠

广西大学生命科学与技术学院（南宁 530004）

麦芽为禾本科植物大麦果实发芽干燥后的加工制品[1]，含有丰富的酶类、多糖类生物物质及大量营养物质[2]，经常食用可益气开胃，具有保健功效[3]。麦芽由于大麦产地较多，产量较佳，被广泛用于食品[4]及医药[5]等行业。小麦胚芽作为加工的副产品，通常被人为抛弃，不能得到充分利用，其本身营养丰富[6]，经常食用可增强体质。Aksoz等[7]使用高效液相色谱（HPLC）对小麦胚芽油进行分析，结果表明其α-生育酚浓度极高。小麦胚芽也被应用于抗氧化肽制备[8]、饼干制作[9]、胚芽糊加工[10]、纳豆制作[11]及饮料制作[12-14]等方面。国内外对麦芽-麦胚芽酒的研究尚未报道，故以麦芽-麦胚芽酒为主要研究对象，从3种酶澄清剂中筛选酸性蛋白酶作为最佳澄清剂，对其澄清工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麦芽、麦胚芽（山东淄博瑞源生物科技有限公司）；麦芽-麦胚芽酒（实验室自酿）；酒曲（南宁一明生物科技有限公司）；果胶酶、酸性蛋白酶、木瓜酶（南宁庞博生物工程有限公司）。

1.2 仪器与设备

SN510C全自动高压灭菌锅（重庆雅玛拓科技有限公司）；SHP-250生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；JJ-2组织捣碎机（常州迅生仪器有限公司）；YP201N电子天平（上海菁华科技仪器有限公司）；PL-303分析天平（METTLER TOLEDO有限公司）；恒温水浴锅（重庆雅马拓科技有限公司）；UVmini-1240紫外-可见分光光度计[岛津仪器（苏州）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 麦芽-麦胚芽酒的酿造工艺

精选麦芽→组织捣碎机粉碎→加入麦胚芽（麦芽与麦胚芽质量比3.5∶1）→加水混匀（料液体积比1∶3）→65 ℃糖化→取上清→高温灭菌→接种酒曲→28℃发酵7 d→酒渣分离→澄清过滤→原酒→杀菌灌装→成品

1.3.2 最佳酶澄清剂筛选[15]

选用木瓜酶、酸性蛋白酶、果胶酶3种酶澄清剂，分别将3种酶按照0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L质量浓度加入到麦芽-麦胚芽酒中，在50 ℃水浴条件下澄清6 h后取出，室温静置2 d后于波长750 nm测定透光率。

1.3.3 单因素澄清试验

酸性蛋白酶添加量对澄清效果的影响：将酸性蛋白酶按照0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 g/L质量浓度加入到麦芽-麦胚芽发酵酒中，充分摇匀，在50 ℃水浴条件下澄清6 h后取出，室温静置2 d后按上述方法测定透光率。

澄清时间对澄清效果的影响：将酸性蛋白酶按照0.8 g/L质量浓度加入到麦芽-麦胚芽酒中，充分摇匀，在50 ℃水浴条件下分别澄清0，3，6，9，12和15 h后取出，室温静置2 d后按上述方法测定透光率。

澄清温度对澄清效果的影响：将酸性蛋白酶按照0.8 g/L质量浓度加入到麦芽-麦胚芽发酵酒中，充分摇匀，分别设置水浴温度35，40，45，50，55和60℃，澄清6 h后取出，室温静置2 d后按上述方法测定透光率。

1.3.4 响应面试验设计优化澄清工艺

在单因素试验基础上，采用响应面方法优化澄清工艺，以酸性蛋白酶添加量（A）、澄清时间（B）、澄清温度（C）3个因素为自变量，以透光率（Y）为响应值，根据Box-Behnken试验设计原理，设计三因素三水平试验进行优化，进行响应面分析，并验证结果的可靠程度。响应面因素与水平见表1。

表1 澄清工艺优化Box-Benhnken试验设计因素与水平

1.3.5 数据处理与分析

所得数据通过Origin 2017版绘图软件进行展示；响应面法采用Design-Expert V 8.0.6软件进行设计，并进行数据分析；采用SPSS 21.0统计软件进行方差分析和显著性检验（p＜0.05）。

1.3.6 理化指标测定

酒精度，采用酒精计法测定[16]；还原糖含量，采用DNS法测定[17]；蛋白质含量：采用考马斯亮蓝法测定[18]；总酚含量，采用福林-肖卡法测定[19]。

2 结果与分析

2.1 最佳酶澄清剂筛选

由图1可知，在相同添加量、相同澄清温度、相同澄清时间情况下，木瓜酶与果胶酶对麦芽-麦胚芽酒澄清效果不佳，最大透光率仅50%～60%，酸性蛋白酶对麦芽-麦胚芽酒的澄清效果要优于木瓜酶和果胶酶，可达80%以上，故选用酸性蛋白酶作为最佳酶澄清剂。

图1 不同酶澄清剂澄清效果对照

2.2 单因素澄清试验

2.2.1 酸性蛋白酶添加量对澄清效果的影响

由图2可知，随着酸性蛋白酶逐渐增加，透光率呈现出逐渐增长趋势，透光率在0～0.6 g/L添加量范围内急速增长，这是由于酶的添加可加速分解酒中大分子物质；透光率在0.6～1.0 g/L添加量范围内增长速度变缓，这是因大分子物质逐渐减少而酶逐渐过量所引起的。透光率在酶添加量1.0 g/L时达到最大，为80.9%。

图2 酸性蛋白酶添加量与澄清效果的关系

2.2.2 澄清时间对澄清效果的影响

由图3可知，随着澄清时间增加，透光率呈现出先上升后下降趋势。澄清时间在0～3 h范围内透光率呈现急速上升趋势，这是由酶的添加所引起的；澄清时间在3～12 h范围内透光率曲折增长，并在澄清时间12 h时达到最大透光率85.2%。随后透光率略微降低，这与沉淀的结实紧密度有关，沉淀紧密度差随静置时间延长而产生重新分散现象，从而导致透光率下降。这就要求在生产过程中应尽快将产生沉淀的上清液分离。

图3 澄清时间与澄清效果的关系

2.2.3 澄清温度对澄清效果的影响

由图4可知，随着澄清温度升高，透光率呈现先增大后减小趋势。澄清温度在35～55 ℃范围内透光率逐渐增加，并澄清温度55 ℃时透光率达到最大，可达87.9%。随后透光率略微降低，这是因为酸性蛋白酶的最适温度55 ℃，高于最适温度时，高温会导致蛋白酶的变性失活，影响催化能力，从而影响透光率。

图4 澄清温度与澄清效果的关系

2.3 发酵酒澄清工艺响应面优化

2.3.1 响应面模型的建立及分析

在单因素试验所得数据基础上，进行Box-Behnken试验设计，以酸性蛋白酶添加量（A）、澄清时间（B）、澄清温度（C）3个因素为自变量，以透光率（Y）为响应值，应用Design-Expert V 8.0.6软件对试验所得数据进行回归拟合及分析。利用软件对试验数据进行回归拟合，所得自变量与透光率的二次多项回归方程为Y=84.28+3.69A-0.14B+0.100C-0.83AB-0.20AC-0.80BC-0.48A2+1.37B2+0.70C2。

所得响应面优化试验方案及结果如表2所示，模型分析如表3所示。

表2 响应面试验设计与结果

由表3可知，模型p=0.0228＜0.05，达到显著水平，表明响应面试验所得模型可靠，拟合良好，可用于后续优化。失拟项p=0.6912＞0.05，显著水平为不显著，表明方程拟合良好，未出现失拟现象，试验方法可靠性高。因素A的p值=0.0004＜0.01，表明酸性蛋白酶添加量对于麦芽-麦胚芽酒的澄清效果极显著；因素B、C的p值均大于0.05，表明澄清时间与澄清温度对于麦芽-麦胚芽酒的澄清效果不显著；交互项AB、AC、BC，以及A2、B2、C2的p值均大于0.05，表明上述因素对于麦芽-麦胚芽酒的澄清效果不显著，且酸性蛋白酶添加量、澄清时间、澄清温度之间的交互作用较弱。由F值可知因素A＞B＞C，表明所选取的3个因素对于酒体澄清效果的影响顺序为酸性蛋白酶添加量＞澄清时间＞澄清温度。

表3 回归模型方差分析结果

由表4可知，拟合度R2=0.8652，校正拟合度Radj2=0.6918，两者数据较接近，表明所建立模型与实际试验拟合较好，准确性较高；变异系数C.V.=1.97%＜5.0%，表明方程可重现性较好[20]；信噪比=7.265＞4，表明模型可信度较高，试验精密度较高。综上所述，可利用该模型进行分析各因素变化对响应值的影响，并预测其变化规律。

表4 方差相关系数

2.3.2 各因素交互作用分析

响应面图等高线椭圆形越明显，表明各因素间交互作用越强，反之则越弱。各因素交互作用如图5所示。

图5 各因素交互作用对麦芽-麦胚芽酒透光率影响的响应曲面及等高线

AB、AC、BC的响应曲面图等高线均不是椭圆形，表明各因素交互作用不强，这与表3方差分析结果一致。

2.3.3 澄清效果验证

通过Design-Expert V 8.0.6软件所得到的回归模型，预测的麦芽-麦胚芽酒澄清条件理论最佳值为酸性蛋白酶添加量1.2 g/L、澄清时间9 h、澄清温度60 ℃。预测最佳透光率为91.2225%，其可行性达到0.557，结果如图6所示。

图6 预测条件可行性

按照试验条件进行模拟，麦芽-麦胚芽酒的实际透光率为90.1%，与理论预测值91.2225%相差较小，可以采用。因此，响应面法优化澄清工艺结果置信度较高，实际可行性较强。

2.3.4 理化性质测定

澄清剂的添加虽然降低了酒中部分物质含量，但是提高了酒体透光率。麦芽-麦胚芽酒澄清前后的部分理化指标如表5所示。

表5 澄清前后理化指标对比

酒精度由澄清前的7.2%vol降至6.5%vol，还原糖质量浓度由10.6 g/L降至7.3 g/L，蛋白质质量浓度由120.45 mg/L降至94.52 mg/L，总酚质量浓度由3.4 g/L降至2.7 g/L。澄清后的酒体清澈鲜亮，色泽极佳。

3 结论

试验从3种酶澄清剂中筛选酸性蛋白酶作为最佳酶澄清剂，通过单因素试验选取最佳条件，通过Design-Expert V 8.0.6软件进行Box-Benhnken试验设计，以酸性蛋白酶添加量、澄清时间、澄清温度为自变量，麦芽-麦胚芽酒的透光率为响应值，对试验数据进行回归拟合，所得自变量与透光率（Y）的二次多项回归方程为Y=84.28+3.69A-0.14B+0.100C-0.83AB-0.20AC-0.80BC-0.48A2+1.37B2+0.70C2，最佳澄清条件为酸性蛋白酶添加量1.2 g/L，澄清时间9 h，澄清温度60 ℃，自然静置状态下得到的最终酒体透光率为90.1%，所得麦芽-麦胚芽酒品质极佳，为酸性蛋白酶用于酒类澄清提供参考。