哈尔滨地区不同泌乳阶段母乳中低聚糖变化的研究

郭文奎，李博文，刘丽波

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨150030；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030)

0 引 言

母乳是婴儿成长过程当中最自然、最安全、最完整的天然食物，它含有婴儿成长所需的所有营养。世界卫生组织建议，在婴儿6个月前给予纯母乳喂养，6个月到2岁或更长时间内，在继续母乳喂养的同时添加辅食[1]。母乳中含有乳铁蛋白、碳水化合物、蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、脂肪酸和牛磺酸等众多营养成分。而母乳的营养成分也会随着产后母体的变化，以及哺乳的不同阶段而发生变化。同时，母乳中会含有大量抗体，对婴幼儿健康生长发育是非常重要的[2]。

母乳低聚糖（HMOs）是一类存在于人乳中的复杂混合低聚糖，是母乳中的重要成分之一，在母乳中含量为5～15 g/L，具有很高的生物活性。HMOs不仅具有独特的益生元作用，可以影响婴儿肠道菌群的构建，而且对婴儿的大脑发育、抗感染、免疫调节以及体内信号传导等都有十分重要的作用[3-4]。有研究表明，HMOs的含量和组成是随着哺乳期时间变化而变化的。随着哺乳时间的延长，母乳中HMOs的浓度逐渐下降。研究显示在美国人群中，HMOs的浓度从哺乳期开始10天时的19.3 g/L降低至120天时的8.53 g/L[5-6]。

研究HMOs必须解决的关键问题是定性和定量的检测方法。由于母乳中含有大量的脂肪和蛋白质，同时由于HMOs又是十分复杂的低聚糖混合物[7-8]，结构多样，同时包含多个同分异构体，且没有内在的发色团，使得HMOs的定性和定量检测具有一定的难度[9-10]。要获得HMOs的绝对含量，仍然需要标准品和标准曲线的方法。本试验应用LC-MS建立快速、稳定、灵敏度高的检测母乳中低聚糖定性及定量的方法，应用该方法分析不同哺乳期过程中各种低聚糖的变化情况。

1 实 验

1.1 材料与试剂

1.1.1 母乳样品采集

选择黑龙江省哈尔滨地区哈尔滨医科大学附属第一医院产科健康、足月生产、自愿捐献的22～35岁母亲，同时签署知情同意书。在医院期间取母乳时间为产后泌乳开始的第3、7天。出院后，样品由母亲产后到院检查时收集，确保每月收集1次。收集单侧全部乳汁并混匀后取其中5 mL至冻存管于-80℃冰箱冻存。本研究共收集63位母亲的母乳样品。

1.1.2 试剂

3'-fucosyllacos（3'-FL）、2'-fucosyllacose（2'-FL）、6'-siallyllactose（6'-SL）、3'-siallyllactose（3'-SL）、lacto-N-tetraose（LNT）、lacto-N-neotetraose（LNnT）、Lacto-N-fucopentaoseⅠ（LNFP-Ⅰ），美国Sigma-Aldrich公司；乙腈，美国Fisher公司。所用试剂均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

Waters TQ-S电喷雾质谱仪，Waters Acquity UPLC system，美国Waters公司；Eppendorf 5430R低温高速离心机，德国Eppendorf公司；SW-CJ-2FD超净工作台，上海博迅实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

母乳样品解冻后，取1 mL乳样与1 mL纯净水混合均匀，震荡1 min，冷冻离心机4 600 g离心10 min，用移液器除去上层脂肪，加入3 mL乙腈震荡1 min，超声10 min，冷冻离心机11 000 g离心10 min，重复两次，去除沉淀蛋白，上清液为母乳低聚糖，经0.22μm膜过滤后进行HMOs组分检测，并以HMOs标准品作对照外标定量分析。

1.3.2 色谱质谱条件

色谱柱：Inertsil Hilic柱(2.1 m×150 mm)；流动相：A液为乙腈，B液为50 mol/L乙酸铵溶液(p H 4.5)。样品置于4℃自动进样器中，柱温40℃，流速400μL/min，进样量5μL。梯度洗脱条件：95%流动相A和5%流动相B洗脱2 min，然后至13 min流动相B由5%至25%，然后至18 min流动相B由25%至50%，保持洗脱6 min。

采用Waters TQ-S质谱仪在负离子模式下进行质谱分析。ESI源条件如下：离子源温度325℃，离子源电压（ISVF）：4 000 V；采用MRM模式检测待测离子对。

采用skyline软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 色谱质谱分离方法

本实验使用Waters TQ-S电喷雾质谱仪通过梯度洗脱的方法分离HMOs，色谱分离图见图1，图2。从图中可以看出，应用该方法可以成功检测HMOs，6种HMOs标准品出峰保留时间在10～20 min之间，出峰顺序依次为3'-FL、2'-FL、6'-SL、LNnT、3'-SL、LNFP-I。经前处理的母乳样品应用该方法进行分离检测时，6种HMOs均能有效分离。表明实验中梯度洗脱条件符合HMOs检测，可进一步进行后续实验。

图1 6种母乳低聚糖标准品色谱图

图2 母乳低聚糖样品色谱图

6种HMOs标准曲线、R2、回收率及RSD见表1，从表中可见：6种HMOs标准曲线线性关系良好，R2均高于0.99，RSD值均小于10%，每种低聚糖回收率均测定符合80%～120%的标准，表明该实验方法可以对6种目标HMOs进行快速、全面的定性及定量分析。

表1 母乳低聚糖标准曲线方程及回收率

2.2 母亲泌乳期内HMOs含量变化

本实验采用Waters TQ-S电喷雾质谱仪对不同泌乳期的母乳低聚糖进行检测，我们将不同泌乳期的母乳分为初乳、过渡乳及成熟乳。其中，初乳是生产后第1到第12天的母乳，过渡乳是生产后第13天至第30天的母乳，成熟乳是生产后第2个月以后的母乳。从表2中我们可以看到，在收集的所有不同泌乳期母乳样品中，检测到6种HMOs的组成和含量均在不断变化。其中2'-FL、6'-SL、LNnT、LNFP-I的含量随着泌乳期的延长而逐渐降低。6种HMOs中，只有3'-FL的含量随着泌乳期的延长而逐渐升高，而3'-SL的含量随着泌乳期的延长含量先降低后升高。从表2中可以看到，HMOs在不同的泌乳期含量不同，泌乳初期相对含量更多，随着泌乳时间的延长，大部分HMOs在母乳中的含量逐渐降低。

表2 不同泌乳阶段母乳低聚糖含量变化

2.3 不同分泌型母亲泌乳期内HMOs变化

2-岩藻糖基乳糖（2'-FL）和3-岩藻糖基乳糖（3'-FL）是重要的母乳低聚糖类，而2'-FL已添加到婴幼儿配方奶粉中以缩小母乳替代品与母乳间功能性的差距。母亲携带岩藻糖基转移酶2(FUT2)基因类型可影响母乳中HMO成分，这直接影响了婴儿肠道菌群的定植时间和发展。基因的突变可导致其编码的FUT2失活，将FUT2基因处于活化状态的人群归类为分泌型，失活状态的人群为非分泌型，而不同分泌型母亲在哺乳期所分泌母乳中乳糖岩藻糖基化的过程会发生变化[11]。在本研究中我们发现，随着泌乳期的延长，2'-FL的含量随着泌乳期的延长在逐渐降低，而3'-FL的含量则逐渐升高。有研究应用2'-FL/3’-FL的相对含量比例进行泌乳母亲分型，2'-FL/3'-FL的相对含量比例大于6.5为分泌型母亲，而2'-FL/3'-FL的相对含量比例低于6.5则为非分泌型母亲[12]。从表3中我们可以看到，我们所收集的母乳低聚糖的母亲多为分泌型母亲，分泌型与非分泌型母亲的比例为42∶21，分泌型母亲占比为66.7%，分泌型母乳中HMO的组成成分不同于非分泌型，特别是2'-FL和3'-FL的含量区别较大。在分泌型母亲的母乳中，2'-FL的含量要高于非分泌型母亲母乳的含量，而在非分泌型母亲的母乳中，3'-FL的含量要略高于分泌型母亲母乳的含量。

表3 不同分泌型母亲母乳中低聚糖含量

3 结 论

3.1 生产方式对母乳低聚糖含量的影响

通过检测分析产妇泌乳后母乳低聚糖含量及组分变化情况发现，通过自然生产的产妇母乳中低聚糖的含量与剖腹产产妇母乳中低聚糖的含量有一定的差异。其中，通过自然生产的产妇母乳中2'-FL、LNFP-I的含量均略高于剖腹产产妇母乳中的含量。而剖腹产产妇母乳中LNnT的含量则略高于自然生产的产妇母乳中的含量。这表明，生产方式可能对产妇母乳中低聚糖的含量有一定的影响[13]。

3.2 个体差异对母乳低聚糖含量的影响

通过采集的63位母亲的母乳样品中6种HMOs的统计分析结果我们发现，个体差异对母乳中低聚糖的含量有一定的影响。其中，2'-FL的浓度在母亲母乳中的变动范围较大，在泌乳初期达到最高值，然后随着泌乳时间的延长含量逐渐减少。而3'-FL是所有6种HMOs成分中唯一一种含量随着泌乳时间延长而基本保持增加的低聚糖。研究发现，大部分母亲的母乳样品中均含有这6种HM Os，但部分母亲的母乳样品中未检测到2'-FL及LNFP-I，这表明母体差异对母乳低聚糖的含量及组分有一定影响[14-15]。

已有研究发现，HMOs具有调节免疫，帮助大脑发育及调节婴儿肠道菌群等功能，有助于婴幼儿早期成长发育[16-17]。上个世纪九十年代，许多乳品企业将一些双歧杆菌活性低聚糖作为母乳低聚糖的替代物添加到婴儿配方奶粉中。目前，许多国外生产婴儿配方粉的乳品企业已经在生物合成母乳低聚糖方面取得了重大成功。目前，经欧盟和美国批准并且能够商业化的母乳低聚糖一般是2'-FL、LNnT两种。在我国，针对中国母乳HMOs的研究还处于初级阶段，特别是在母乳低聚糖的合成方面研究较少。因此，应加大对中国国内不同地区、不同种族、不同生活习惯、不同生产方式、不同年龄的产妇母乳收集，建立中国母亲母乳中HMOs数据库，为中国自主乳品企业生产添加母乳低聚糖的婴儿配方粉提供理论依据。