养鸡场混合感染的分离鉴定与药敏试验

文│李佳璇 宋祥军（安徽农业大学动物科技学院）

王苗利 蔺晓月 陈静 孙圣福（山东省动物疫病预防与控制中心）

邹本革（青岛农业大学海都学院）

近年来，随着养鸡业规模化、集约化的发展，以及饲养管理不当，使得养殖场常发生两种或两种以上病原体的混合感染。鸡大肠杆菌常与其他细菌、病毒等病原体混合或继发感染，蛋鸡和肉鸡更易发病，生殖系统炎症对于蛋鸡养殖危害较为严重。如某养鸡场因饲养管理不当，鸡群抵抗力下降，引起大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的混合感染，导致蛋鸡发病死亡，经济损失惨重。当多种病原体混合感染时，单一用药或使用抗生素可能达不到理想的治疗效果，还会大大增加临床诊断及治疗的难度，严重危害养鸡业的发展。为了避免病情加重，产生耐药菌株等不良后果，可采取联合用药或几组敏感药物交替使用的方法来治疗多种病原体的混合感染。

金黄色葡萄球菌（SA），属于葡萄球菌属革兰氏阳性菌，是一种常见的食源性致病微生物，常引起化脓性疾病、败血症等。鸡感染SA后会引起败血症和病理变化，雏鸡多表现为急性，青年鸡表现为急性或慢性，成年鸡表现为慢性，感染后死亡率最高的是雏鸡。大肠杆菌属肠杆菌科、埃希菌属，有菌毛、荚膜和微荚膜，是革兰氏阴性短杆菌，有鞭毛，可运动。禽致病性大肠杆菌（APEC）能引起肉鸡的心包炎、肺泡炎、肝周炎及败血症；蛋鸡出现输卵管炎和败血症，导致蛋鸡死亡率上升，产蛋率下降。

随着我国养殖业不断发展壮大，抗生素的使用成了畜禽养殖过程中不可或缺的环节，但是抗生素的使用并没有得到有效的监管，许多散养户在没有兽医的指导下随意使用抗生素，不仅达不到治疗效果，反而会出现其他不良症状。通过实验室对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行鉴定和药敏分析，可以指导正确的临床用药，确定其敏感药物，对防止抗生素滥用以及产生细菌耐药性具有重大意义，为临床治疗金黄色葡萄球菌病和大肠杆菌病混合感染提供科学依据。

一、材料与方法

1.材料。

（1）主要仪器设备。梅里埃生化及药敏仪VITECⅡcompact60，奥林巴斯显微镜，罗氏自动核酸提取仪，罗氏荧光定量PCR仪，生物安全柜，移液器（0～300微升）。

（2）主要试剂盒。禽传染性支气管炎病毒（AIBV）核酸检测试剂盒，购自广州伯鑫生物科技有限公司；禽流感病毒荧光PCR检测试剂盒，购自北京森康生物技术开发有限公司；鸡传染性新城疫病毒荧光RTPCR检测试剂盒，购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司。

（3）主要试剂材料。科马嘉显色培养基，梅里埃药敏分析卡，革兰氏染色液，0.45%氯化钠溶液，营养琼脂，0.01M的PBS缓冲液（pH7.2）。

◎图1 新城疫病毒RT-PCR扩增图像

◎图2 传染性支气管炎病毒RT-PCR扩增图像

◎图3 禽流感病毒RT-PCR扩增图像

2.试验方法。

（1）发病情况调查。调查了山东省济南市章丘区某养殖场蛋鸡发病情况，调查内容包括该养殖场鸡存栏量、死亡数量、发病日龄、临床症状、免疫和用药情况以及剖检情况，并对该养殖场饲养环境、消毒情况进行记录。

（2）病毒检测。采取5只病死鸡肝，分别研磨，制成混悬液，离心。按照试剂盒使用说明进行荧光RTPCR扩增。

（3）细菌分离鉴定及药敏分析。一是病料接种培养。选取病料病变交界处的区域，在显色培养基上划线接种，将培养基倒置，放于37℃温箱培养24小时。二是细菌染色镜检。将细菌固定在洁净玻片上，采用革兰氏染色法将细菌染色。在100倍油镜下观察染色结果。三是细菌分离纯化。挑取显色培养基上的单个菌落，在营养琼脂平板上划线接种，37℃恒温纯化培养24小时。四是细菌16S rRNA鉴定及绘制进化树。进行16S rRNA测序，并使用生物信息学MEGA6.0软件，绘制进化树。五是细菌药敏分析。挑取纯化好的单菌落，在氯化钠溶液中混匀，制备成菌悬液，插入药敏分析卡，待18小时后读取结果。

二、结果与分析

1.发病情况调查结果。该养殖场存栏鸡4000只，主要是蛋鸡发病死亡。病鸡的粪便正常，无呼吸道及其他症状，基本上是突然死亡。该养殖场在发病后使用庆大霉素进行治疗，但并未达到治疗效果。解剖发现，病死鸡肝轻微肿大且易碎，心肌内膜出血。实地调查后发现，该养殖场生物安全防控不到位，饲养环境较差，没有及时清理粪便，通风较差，鸡舍消毒不彻底，对饲养人员管理不严格。

2.病毒检测结果。

（1）新城疫病毒检测结果。鸡新城疫病毒RT-PCR结果见表1，新城疫病毒RT-PCR扩增图像见图1。由表1可知，本次测定的5份样品核酸的CT值＞40，无阳性结果；由图1可知，其扩增曲线为一条直线，与阴性对照相符，新城疫病毒检测结果为阴性，因此该养殖场的蛋鸡并非新城疫病毒感染。

表1 鸡新城疫病毒RT-PCR结果判定

（2）传染性支气管炎病毒检测结果。传染性支气管炎病毒RT-PCR结果见表2，传染性支气管炎病毒RTPCR扩增图像见图2。由表2可知，本次测定的样品核酸无CT值；由图2可知，其扩增曲线为一条直线，与阴性对照相符，传染性支气管炎病毒检测结果为阴性，说明该养殖场的蛋鸡并非传染性支气管炎病毒感染。

表2 传染性支气管炎病毒RT-PCR结果判定

（3）禽流感病毒检测结果。禽流感病毒RT-PCR结果见表3，禽流感病毒RT-PCR扩增图像见图3。由表3可知，本次测定的样品核酸无CT值；由图3可知，其扩增曲线为直线，与阴性对照相符，禽流感病毒检测结果为阴性，表明该养殖场的蛋鸡并非禽流感病毒感染。

表3 禽流感病毒RT-PCR结果判定

3.细菌分离鉴定及药敏分析结果。

（1）病料接种结果。显色培养结果见图4～8。由图可知，培养基上生长出两种不同颜色的菌落，分别为黄色菌落和紫色菌落。

（2） 染色镜检结果。染色镜检结果见图9和图10。由图9可知，黄色菌落为革兰氏阳性球菌，呈蓝紫色、葡萄串样；由图10可知，紫色菌落为革兰氏阴性短杆菌，呈红色、棒状。

（3）分离纯化结果。两种细菌纯化效果良好，无杂菌生长。

◎图9 金黄色葡萄球菌革兰氏染色情况

◎图10 大肠杆菌革兰氏染色情况

（4）16S测序及绘制进化树结果。

16S测序结果。16S的测序鉴定结果见表4。由表4可知，菌种1与大肠杆菌的同源性为99.36%，菌种2与金黄色葡萄球菌的同源性为100%。

表4 两种菌的16S鉴定结果

进化树绘制。进化树见图11。对1809007A和1809007B分离菌株的16S片段采用生物信息学MEGA6.0软件，选择NJ（Neighbor-Joining，邻接法）、Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）模型和Bootstrap 1000，构建遗传进化树，进行遗传进化分析。其中，红色三角标注的为分离菌株。由进化树可以看出，1809007A菌株与Escherichia coli 16S ribosomal RNA，J01859.1和Escherichia coli strain NBRC102203NR_114042.1 菌株同源性较高，处于同一分支，同源性为99.6%，推断1809007A为大肠杆菌菌株。1809007B菌株与Staphylococcus aureus strain ATCC 12600 NR_115606.1和Staphylococcus aureus subsp. anaerobius strain NR_036828.1同源性较高，同源性为100%，推断1809007B为金黄色葡萄球菌。

◎图4～8 分别为病料1～5的显色培养结果

（5）金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的药敏结果。纯化好的革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌制备成均匀的菌悬液，分别插入药敏卡，放入梅里埃生化及药敏仪VITECⅡcompact60中，反应18小时，观察结果：金黄色葡萄球菌药敏分析结果见表5，大肠杆菌药敏分析结果见表6。

表5 金黄色葡萄球菌药敏分析结果

表6 大肠杆菌药敏分析结果

根据表5中的MIC值和解释结果可知，该养殖场金黄色葡萄球菌最为敏感的药物为氨苄西林（MIC值为0.06）；其次是替加环素、苯唑西林和庆大霉素；环丙沙星、四环素等药物不敏感。

根据表6中MIC值和解释结果可知，该养殖场大肠杆菌最敏感的药物为厄他培南（MIC值≤0.5）和环丙沙星（MIC值为0.5）；其次为亚胺培南和左氧氟沙星；庆大霉素、头孢类及青霉素类药物等不敏感。

三、结论与讨论

1.结论。该养殖场经实验室检测确诊为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合感染，金黄色葡萄球菌对氨苄西林敏感，大肠杆菌对厄他培南与环丙沙星敏感。根据喹诺酮类药物与青霉素类药物配伍在治疗某些细菌病时具有协同作用，因此选用氨苄西林与环丙沙星配合使用，协同增强药效。在该养殖场混合使用这两种药物，取得了良好的治疗效果，为临床上大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合感染提供了合理的治疗方案。

◎图11 大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的进化树

2.加强饲养管理。近年来，在蛋鸡的养殖过程中，病原体混合感染的病例越来越多，给我国养鸡业带来了较大危害。该养殖场鸡群被金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合感染，主要原因是该养殖场对于生物安全的重要性认识不够，鸡舍通风不畅，粪便清理不及时，鸡舍消毒不彻底，鸡舍环境较差，导致鸡群免疫力下降，被环境中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌感染而患病。大肠杆菌与金黄色葡萄球菌都是条件致病菌，饲养管理不当、不注重生物安全都会增加感染风险，因此建议该养鸡场场主加强对生物安全知识的学习，强化养殖场内的饲养管理，加强鸡群疫病检测、防控工作：定期对鸡进行预防接种；及时清理粪便，加强卫生消毒，做好鸡舍内的卫生工作；注意给鸡群做好防寒保暖，适当补充光照；科学饲喂，严格控制饲养人员流动。

3.重视实验室检测。该养殖场在鸡群发病前期根据过往经验，使用了庆大霉素一种抗生素进行治疗。后经实验室鉴定，发病鸡是由金黄色葡萄球菌和大肠杆菌这两种细菌感染导致的，庆大霉素只对金黄色葡萄球菌敏感，对大肠杆菌并不敏感，因此经过一段时间的用药不仅未见好转，反而损失惨重。胡慧等对河南某养鸡场感染大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的雏鸡进行药敏试验，结果是环丙沙星与庆大霉素是这两种菌的首要敏感药物，对氨苄西林不敏感。本实验室通过药敏分析，筛选出这两种细菌的敏感药物是氨苄西林与环丙沙星，与胡慧等的药敏分析结果不完全一致，因此不可盲目参考其他养殖场的治疗方案。由此可知，实验室检测对于临床诊断和治疗意义重大，经过实验室的检测不仅可以精确诊断出病原微生物，还可以指导科学用药，大大降低死亡率，减少养殖场户的经济损失，对我国养鸡业的发展具有重要意义。