基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

王飘，郑晴，胡婷，张海银，许言午，包怡敏

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路的三七总皂苷调控自噬抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制研究

王飘，郑晴，胡婷，张海银，许言午，包怡敏

上海中医药大学基础医学院，上海 201203

探讨三七总皂苷（PNS）能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬从而减轻H9c2细胞缺氧/复氧损伤机制。将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧（A/R）组、A/R＋PNS组、A/R＋PNS＋雷帕霉素（Rapa）组、A/R＋Rapa组、A/R＋羟氯喹（HCQ）组、A/R＋3-甲基腺嘌呤（3-MA）组。通过缺氧6 h、复氧2 h建立H9c2细胞A/R模型。CCK-8法检测细胞存活率，乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒检测细胞损伤，Western blot检测自噬相关蛋白Atg5、p62、Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、Akt、mTOR的表达，荧光法观察细胞自噬流。与正常组比较，A/R组H9c2细胞存活率明显下降，细胞损伤率明显升高（＜0.05），自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高（＜0.05），自噬体和自噬溶酶体数量显著增加，自噬流显著增强（＜0.05）；与A/R组比较，用PNS预处理后，H9c2细胞存活率明显上升，细胞损伤率明显降低（＜0.05），自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低（＜0.05），p62蛋白表达明显升高，与自噬抑制剂HCQ、3-MA作用相似，荧光结果显示，PNS对自噬流有明显抑制作用（＜0.05）；PNS预处理后p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达明显升高（＜0.05）。PNS能有效减轻H9c2细胞A/R损伤，其机制与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路从而抑制自噬流相关。

三七总皂苷；缺氧/复氧损伤；自噬；PI3K/Akt/mTOR信号通路；H9c2细胞

缺血性心脏病发病率逐年上升，迄今已成为发病率及致死率最高的疾病之一[1]。虽通过药物或手术等手段可达到恢复血流灌注的目的[2]，但恢复过程中可引起不可逆的心肌组织损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）[3]。目前研究表明，细胞自噬作为内源性调节机制参与到MIRI过程中[4]，抑制过度自噬可减轻MIRI[5]。研究发现，激活PI3K/Akt/mTOR信号通路可抑制自噬并减少细胞氧化应激的发生[6-7]。中药毒副作用小、安全性高，对MIRI防治效果较好。现代药理研究发现，三七主要成分三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）能通过抗氧化应激、抗凋亡等途径减轻MIRI[8-9]，但其能否通过调节自噬减轻MIRI仍不清楚。因此，本研究通过观察PNS对缺氧/复氧H9c2细胞的影响，运用自噬激动剂及自噬抑制剂等工具药，观察PNS对自噬流的作用，探讨PNS能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬流，从而达到减轻MIRI的目的。

1 材料与方法

1.1 细胞株和药物

H9c2细胞，中国科学院上海细胞库。血栓通注射液（成分PNS），昆明制药集团股份有限公司，批号13HK03；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），MCE，批号HY-19312；自噬抑制剂羟氯喹（HCQ），Selleck，批号S4430；自噬激动剂雷帕霉素（Rapa），MCE，批号HY-10219。

1.2 主要试剂与仪器

CCK-8，上海翊圣生物科技有限公司，批号40203ES76；乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒，同仁化学研究所，批号CK12；DAPRed，同仁化学研究所，批号D677；DALGreen，同仁化学研究所，批号D675；SQSTM1/p62（CST，货号5114s）、Beclin-1（CST，货号3495s）、LC3B/MAP1LC3B（Novus，货号NB100-2220）、Atg 5（CST，货号12994s）、Akt（CST，货号4691s）、p-Akt（CST，货号4060s）、PI3K（CST，货号4257S）、p-PI3K（Abcam，货号ab182651）、mTOR（CST，货号2983S）、p-mTOR（CST，货号5536S）抗体。全自动凝胶成像系统，上海天能公司，型号Tanon-2500；激光共聚焦显微镜，德国徕卡，型号TCS SP8；细胞培养箱，美国Thermo Scientific，型号class100；超净台，苏州净化设备公司，型号SW-CS-IFD。

1.3 分组、造模及给药

将H9c2细胞分为正常组、缺氧/复氧（A/R）组、A/R＋PNS组、A/R＋PNS＋Rapa组、A/R＋Rapa组、A/R＋HCQ组、A/R＋3-MA组。造模前H9c2细胞分别用含PNS（100 μg/mL）、Rapa（50 nmol/L）、HCQ（50 μmol/L）、3-MA（5 mmol/L）的培养液处理2 h。A/R模型制备时，细胞培养液更换为含/不含药物的无血清培养液，将培养皿置于缺氧条件下（95%N2和5%CO2）培养6 h，之后培养液更换为含/不含药物的正常培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养2 h。正常组细胞正常条件下培养箱中培养8 h。

1.4 细胞存活率检测

将细胞按1×105个/孔铺于96孔板，另设只添加培养液的空白组。造模前PNS组根据药物浓度梯度给药2 h；缺氧前PNS组和A/R组分别更换为含/不含药物的无血清培养液；缺氧6 h后，更换为含/不含药物的正常培养液，37 ℃培养箱中培养2 h；2 h后每孔加入10 μL CCK-8，培养1 h，于酶标仪波长450 nm处检测OD值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）＝（模型组OD值－空白组OD值）÷（正常组OD值－空白组OD值）×100%。

1.5 细胞损伤率检测

根据LDH试剂盒说明书配制工作液。造模完成后，每孔加100 μL工作液，用铝箔纸包裹96孔板，避光室温反应30 min；反应结束后每孔加50 μL终止液，并于酶标仪波长490 nm处检测OD值，计算细胞损伤率。细胞损伤率（%）＝（模型组OD值－空白组OD值）÷（正常组OD值－空白组OD值）×100%。

1.6 细胞自噬荧光检测

将细胞按2×105个/皿铺于激光共聚焦专用皿中，培养24 h；依次使用1 µmol/L红色荧光（DAPRed）和0.5 µmol/L绿色荧光（DALGreen）在37 ℃培养箱中孵育30 min[10]；随后进行A/R造模，最后在相同条件下使用激光共聚焦显微镜进行荧光图片拍摄。自噬体被DAPRed染色，自噬溶酶体被DALGreen染色。根据红绿荧光强度判断细胞自噬体、自噬溶酶体数量和自噬流的变化。

1.7 Western blot检测

造模结束后收集细胞，RIPA裂解液裂解细胞，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清得细胞总蛋白；BCA法检测蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，5%BSA封闭1 h，加入稀释的一抗，4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL发光试剂显影蛋白条带，Image J软件测定蛋白条带灰度值。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 三七总皂苷对模型细胞存活率及损伤率的影响

与正常组比较，A/R组H9c2细胞存活率明显降低（＜0.05），细胞损伤率明显升高（＜0.05）；与A/R组比较，PNS浓度为100、200 μg/mL时，H9c2细胞存活率明显升高（＜0.05）；PNS浓度为50、100、200 μg/mL时，H9c2细胞损伤率明显降低（＜0.05）。见图1、图2。综合细胞存活率及损伤率结果可以看出，浓度为100 μg/mL PNS减轻A/R损伤效果最显著。

注：与正常组比较，*P＜0.05；与A/R组比较，#P＜0.05

注：与正常组比较，*P＜0.05；与A/R组比较，#P＜0.05

2.2 三七总皂苷对模型细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响

与正常组比较，A/R组H9c2细胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达差异均无统计学意义（＞0.05）；与A/R组比较，PNS预处理后，H9c2细胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（＜0.05），见图3。

注：A.正常组；B. A/R组；C. A/R＋PNS组；与A/R组比较；#P＜0.05

2.3 三七总皂苷对模型细胞自噬相关蛋白表达的影响

与正常组比较，A/R组H9c2细胞Atg5、Beclin-1蛋白表达明显升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加（＜0.05），p62蛋白表达无明显变化；与A/R组比较，A/R＋PNS组H9c2细胞自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著降低（＜0.05），p62蛋白表达明显升高（＜0.05），见图4。表明PNS对自噬有明显抑制作用，且可能抑制自噬流，其作用与自噬抑制剂HCQ和3-MA一致。此外，A/R＋PNS＋Rapa组H9c2细胞Atg5、Beclin-1蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显低于A/R＋Rapa组，提示PNS逆转了Rapa增强自噬的作用。

2.4 三七总皂苷对模型细胞自噬流的影响

使用自噬荧光染料标记H9c2细胞，DAPRed代表自噬体，DALGreen代表自噬溶酶体。结果显示，正常组DAPRed和DALGreen荧光强度较弱，表明此时自噬程度较低。经A/R造模后各组DAPRed和DALGreen荧光强度均明显增强，见图5a，表明A/R后自噬增强。结果显示，A/R组和A/R＋Rapa组DAPRed和DALGreen荧光强度明显增强（＜0.05），表明自噬流水平显著增加；与A/R组比较，A/R＋PNS组和A/R＋3-MA组DAPRed荧光强度明显降低（＜0.05），见图5b，表明此时自噬体形成较少，但PNS无3-MA作用强。A/R＋PNS组和A/R＋HCQ组DALGreen荧光强度明显低于A/R组（＜0.05），见图5c，表明此时自噬溶酶体数量减少，其可能与前期对自噬体生成抑制有关；也可能是PNS与HCQ作用效果一致，即对自噬溶酶体形成产生抑制作用。此外，A/R＋PNS＋Rapa组DALGreen荧光强度明显低于A/R＋Rapa组（＜0.05），表明PNS可能通过抑制自噬溶酶体形成逆转Rapa的作用。综合自噬蛋白表达与荧光结果发现，PNS可通过抑制自噬体及自噬溶酶体的形成抑制自噬流。

A.正常组；B. A/R组；C. A/R＋PNS组；D. A/R＋PNS＋Rapa组；E. A/R＋Rapa组；F. A/R＋HCQ组；G. A/R＋3-MA组；与正常组比较，*P＜0.05；与A/R组比较，#P＜0.05；与A/R＋Rapa组比较，▲P＜0.05

注：A.正常组；B. A/R组；C. A/R＋PNS组；D. A/R＋PNS＋Rapa组；E. A/R＋Rapa组；F. A/R＋HCQ组；G. A/R＋3-MA组；与正常组比较，*P＜0.05；与A/R组比较，#P＜0.05；与A/R＋Rapa组比较，▲P＜0.05

3 讨论

心肌缺血再灌注可引起心肌细胞损伤甚至死亡，表现为心功能下降、心律失常等。本研究采用H9c2细胞制备A/R模型，模拟在体心肌缺血/再灌注模型，观察PNS对A/R损伤细胞的影响。本实验结果显示，A/R后H9c2细胞存活率明显下降，100、200 μg/mL PNS处理后细胞存活率明显升高。除细胞活力检测外，细胞培养液LDH含量检测也能部分反映细胞损伤情况。LDH在细胞受损或死亡时被释放到细胞外环境。本实验中，不同浓度PNS处理细胞后，其培养液中LDH含量呈剂量依赖性降低，且浓度为50、100、200 μg/mL时较A/R组差异有统计学意义，表明此浓度PNS对H9c2细胞A/R损伤有一定的改善作用。

现有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路可能因损伤、氧化应激等刺激而被激活[11]，是保护心肌减轻MIRI的有效手段之一。此外，PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活与自噬的发生密切相关[12]。当发生MIRI时，PI3K被激活并可上调自噬的关键调节因子，包括Akt，PI3K可磷酸化Akt的Thr308和Ser473位点使Akt活化[13-14]，而活化的Akt可磷酸化mTOR[15]。mTOR是细胞生长和代谢的关键调节剂，其mTORC1亚型也是自噬过程中发挥调节作用的上游活性因子之一[16]。磷酸化的mTOR可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制由局部缺血诱导的瞬时自噬，从而降低MIRI[17-18]。本实验结果表明，A/R组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达无明显变化，PNS组p-PI3K、p-Akt和p-mTOR表达显著升高，表明PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活。

为探讨PNS能否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控自噬，本研究进行了自噬相关实验。心肌缺血时自噬增强，以清除受损的细胞器和细胞；再灌注时过高水平的自噬则加速心肌细胞死亡，导致MIRI[19]。自噬相关蛋白Atg5、Beclin-1表达水平可反映细胞自噬起始阶段的变化情况[20-21]。LC3存在于自噬小体，同时也对自噬体形成具有重要作用[22]，当自噬发生时，LC3Ⅰ大量转化为LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值增加[23]。本研究中，A/R组H9c2细胞Atg5、Beclin-1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高，表明此时自噬水平上升；而PNS处理后H9c2细胞Atg5、Beclin-1表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低，表明PNS逆转了A/R所致的自噬相关蛋白表达升高的趋势，对自噬有一定的抑制作用。p62作为自噬下游阶段的经典标志物之一，也可反映自噬的变化，其可与自噬体内膜上的泛素化底物和LC3结合，并通过在溶酶体系统中形成自噬溶酶体而被降解[24]。当自噬被抑制时，p62蛋白表达升高[25]。本研究结果显示，PNS预处理后，H9c2细胞p62蛋白表达明显升高，结合LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的变化，推测自噬体与溶酶体结合受阻，自噬流处于被抑制状态。

为探明PNS对自噬流的作用，我们通过自噬荧光检测自噬体和自噬溶酶体的形成情况，观察PNS对自噬流上下游环节的作用。细胞自噬荧光检测试剂可观察自噬流的整个过程，以DAPRed标记自噬体，其荧光强度较弱时，表明自噬体数量较少；以DALGreen标记自噬溶酶体，其荧光强度弱时，表明自噬溶酶体数量较少，其生成可能受阻或被过度降解。本实验结果显示，正常组DAPRed和DALGreen荧光强度较弱，表明自噬程度较低；A/R组H9c2细胞DAPRed和DALGreen荧光强度均明显增强，表明A/R可显著增强自噬流。与A/R组比较，A/R＋PNS组和A/R＋3-MA组DAPRed荧光强度明显降低，表明PNS与3-MA作用相似，即可抑制自噬体形成和发展[26]；由于PNS不能完全抑制自噬体的形成，因此使用自噬抑制剂HCQ，结果显示，A/R＋PNS组和A/R＋HCQ组DALGreen荧光强度明显降低，表明PNS与HCQ作用相似，可能抑制自噬溶酶体形成[27]。此外，A/R＋PNS＋Rapa组DALGreen荧光强度低于A/R＋Rapa组，表明PNS可通过抑制自噬溶酶体发挥逆转Rapa的作用。综合自噬蛋白表达及荧光结果，表明PNS影响自噬流的上下游环节，抑制自噬体及自噬溶酶体的形成，从而抑制自噬流。

综上，PNS可通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制自噬流，发挥对A/R H9c2细胞的保护作用，从而达到减轻MIRI保护心脏的作用。

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Study on Panax Notoginseng Saponins Regulate Autophagy Against H9c2 Cells Anoxia/reoxygenation Injury via PI3K/Akt/mTOR Signaling Pathway

WANG Piao, ZHENG Qing, HU Ting, ZHANG Haiyin, XU Yanwu, BAO Yimin

To explore mechanism whether Panax notoginseng saponins (PNS) can regulate autophagy through the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway to reduce anoxia/reoxygenation (A/R) injury of H9c2 cells.H9c2 cells were divided into seven groups: control, anoxia-reoxygenation (A/R), A/R+PNS, A/R+PNS+ Rapamycin (Rapa), A/R+Rapa, A/R+hydroxychloroquine (HCQ), and A/R+3-methyladenine (3-MA). The A/R model of H9c2 cells was established by anoxia for 6 h and reoxygenation for 2 h. Cell survival rate was detected by CCk-8 method; cell damage was detected by LDH detection kit; autophagy-related proteins of Atg5, p62, Beclin-1, LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and PI3K/Akt/mTOR signaling pathway related proteins PI3K, Akt, mTOR expression were detected by Western blot; autophagy flow was observed by fluorescence.Compared with the control group, the cell viability of A/R group was decreased significantly while the cell damage rate was increased (<0.05). The expressions of autophagy-related proteins Atg5, Beclin-1 and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were increased significantly (<0.05); The numbers of autophagosome and autolysosome increased significantly, and the level of autophagic flow increased significantly (<0.05). Compared with the A/R group, PNS preconditioning increased cell viability, reduced cell damage rate (<0.05); The expressions of Atg5, Beclin-1, and LC3Ⅱ/LC3Ⅰ ratio were reduced significantly (<0.05), and the expression of p62 was increased significantly, which were similar to the autophagy inhibitors HCQ and 3-MA; Autophagy fluorescence detection also revealed an inhibition of autophagic flow (<0.05). The expressions of p-PI3K, p-Akt and p-mTOR protein were increased after PNS preconditioning (<0.05).PNS can effectively reduce A/R damage in H9c2 cells, and its mechanism is related to the inhibition of autophagic flow by activating the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.

Panax notoginseng saponins; anoxia/reoxygenation injury; autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; H9c2 cells

R285.5

A

1005-5304(2021)08-0087-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202012070

国家自然科学基金（81303256）

包怡敏，E-mail：yiminbao@163.com

（收稿日期：2020-12-04）

（修回日期：2021-01-05；编辑：华强）