Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7在胃癌变过程中的表达及与细胞凋亡的相关性研究

熊 见，魏宇燕△，李 亮，段 松

重庆大学附属三峡医院：1.医学检验科；2.消化内科；3.病理科，重庆 404000

目前，胃癌是世界上常见的恶性肿瘤，全世界每年有超过120万新发胃癌病例，我国约占40%，病死率居第2位[1]。胃癌的发生是由多因素参与的复杂过程，在正常情况下，胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡之间保持动态平衡,细胞调控机制的紊乱与胃癌的发生关系密切[2-4]。B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和凋亡细胞相关抗体(Apo2.7)是细胞凋亡基因中的重要成员，在细胞凋亡机制网络中居中心地位[5-6]，目前对其研究多采用免疫组化的方法，以定性和半定量为主，而流式定量检测较为少见。由于免疫组化染色方法的局限性，其阴性结果对疾病进程的诊断不及定量方法明确。本研究选取不同类型的凋亡调控相关基因，采用流式细胞术检测其在胃癌变过程中的表达情况，结合对照免疫组化染色阳性表达情况，研究其与胃癌进程的相关性，探讨其在胃癌早期诊断中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年10月至2020年6月在重庆大学附属三峡医院进行胃镜检查的364例受检者的364例标本，其中男204例，年龄35～84岁，中位年龄51岁；女160例，年龄29～81岁，中位年龄59岁；经病理诊断[7]为正常胃黏膜(NOR)73例，慢性浅表性胃炎(CSG)80例，慢性萎缩性胃炎(CAG)67例，肠上皮化生 (IM)35例，黏膜上皮异型增生(GIN) 48例，胃癌 61例。

1.2仪器与试剂 免疫组化染色兔抗人Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7单克隆抗体均采用美国Santa Cruz公司产品；流式细胞抗体PE Caspase-3(美国BD，克隆:19/Caspase-3/CPP32，分类号:610322)；PE Bcl-2(美国BD，克隆:N46-467，分类号:562532)；PE Apo2.7(法国Immunotech S.A.S)；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ(美国BD,分类号:556421)；组织匀浆仪(美国BD-GINimachine-90 250)；流式细胞仪(美国BD FACSCanto Ⅱ)。

1.3方法

1.3.1单细胞悬液制备 消化内窥镜下取新鲜或冷冻组织(1～2 mm)，用磷酸盐缓冲液(PBS)浸湿。将组织和1 mL PBS放入已预洗过的匀浆盘中，将匀浆盘插入组织匀浆仪中进行组织粉碎1 min。用7 μm孔径滤器过滤并用PBS冲洗滤器获得细胞悬液，洗下的细胞放于试管内，250×g离心细胞悬液5 min。弃上清液用PBS重悬细胞沉淀，调节细胞水平至5×105～1×106/mL。

1.3.2流式标本制备 (1)100 μL单细胞悬液冷破膜后分别加入20 μL Bcl-2、Caspase-3抗体及同型对照，2～8 ℃孵育15～30 min，加2 mL PBS(2～8 ℃)后250×g离心5 min，弃上清液，0.5 mL PBS重悬细胞沉淀备检。(2)Apo2.7检测：取100 μL细胞悬液各加在2支试管中，然后加100 μg/mL的Digitonin冰浴透膜20 min，2 mL PBS 250×g离心5 min弃上清液，各加20 μL Apo2.7-PE单抗及同型对照，室温暗处孵育30 min后PBS洗涤，加入含2.5%小牛血清的PBS 0.5 mL重悬置冰浴中备检。(3)细胞凋亡检测管加入5 μL的FITC-Annexin V和5 μL的PI工作液及100 μL单细胞悬液，室温暗处孵育15 min，0.4 mL PBS重悬备检。

1.3.3免疫组化染色 运用免疫组化染色SP法检测所有标本Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表达。主要步骤：(1)将4 μm切片脱蜡，梯度乙醇脱水；(2)将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波热修复10 min；(3)3%H2O2去离子水室温孵育10 min，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3次，每次3 min；(4)除去PBS，滴加非免疫性血清，室温下孵育10 min，滤纸吸干；(5)滴加50 μL第一抗体，4 ℃过夜，PBS冲洗3次，每次3 min；(6)依次加第二、第三抗体，室温下各孵育10 min，PBS冲洗3次，每次3 min；(7)每张切片加入100 μL二氨基联苯胺显色液；(8)自来水冲洗，苏木素复染；(9)自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明；(10)干燥封片。

1.3.4免疫组化结果判定 细胞质内出现棕黄色颗粒显像判为阳性反应。根据阳性细胞的百分率分成4 个等级：阴性(-)，无阳性细胞；+，阳性细胞百分率<30%；++，阳性细胞百分率为30%～70%；+++，阳性细胞百分率>70%。

2 结 果

2.1流式细胞术检测结果比较 在由CSG向胃癌演变的过程中，细胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表达率逐渐降低，而Bcl-2则在这一演变的过程中表达率逐渐增加，至胃癌期到达高峰。除GIN组的细胞凋亡率及Apo2.7表达率与胃癌组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组与胃癌组间细胞凋亡率及Apo2.7表达率差异均有统计学意义(P<0.05)；CAG、IM、GIN、胃癌组与NOR组比较，细胞凋亡率及Caspase-3、Apo2.7表达率差异均有统计学意义(P<0.05)。各组Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表达率及细胞凋亡率见表1，变化趋势见图1。

表1 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7表达情况

图1 Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7表达率及细胞凋亡率在各组病变中的变化趋势

2.2Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表达率与细胞凋亡率的相关性分析 Bcl-2表达率与细胞凋亡率呈负相关(r=-1.198,P<0.05),Caspase-3、Apo2.7的表达率与细胞凋亡率呈正相关(r=0.852、0.867,P<0.05)。

2.3免疫组化结果比较 不同组间Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫组化阳性率见表2。各基因型表达阳性程度和免疫组化阳性率同流式细胞表达率趋势较一致。除GIN组的Apo2.7免疫组化阳性率与胃癌组比较差异无统计学意义(P>0.05)外，其余各组与胃癌组Apo2.7免疫组化阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)，CAG、IM、GIN、胃癌组与NOR组比较，Bcl-2、Caspase-3和Apo2.7的免疫组化阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2 各组Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7免疫组化结果比较

3 讨 论

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其中腺癌在胃的恶性肿瘤中占95%。胃癌早期症状和体征不典型，出现明显症状和体征时已属中晚期，我国每年胃癌新发病例约为67.9万，同期死亡人数更高达49.8万[8]。研究表明，“慢性胃炎-胃黏膜萎缩-IM-异型增生-胃癌”为胃癌的病理学发展模式，胃黏膜细胞凋亡率的进行性下降导致细胞持续增殖并呈高增生状态，过度增殖状态的细胞更易受到致癌物质的损伤，从而增加了DNA畸变的风险，最终可能导致胃癌的发生。研究表明Bcl-2和Caspase-3是重要的两种凋亡抑制基因，其表达与肿瘤的发生、发展存在密切的关系[9-10]。Bcl-2是TSUJIMOTO等最早从伴有t(14；18)(q32；q21)染色体易位的B细胞淋巴瘤中发现的原癌基因，而Caspase-3是Caspase系统中导致细胞凋亡的关键成分，它是细胞线粒体依赖凋亡途径的重要因素，处于凋亡级联反应的下游，是细胞凋亡效应期的重要中心分子。Apo2.7最早是由ZHANG等[11]报道的新的细胞凋亡标志物，有促进细胞凋亡的作用，主要通过线粒体途径介导细胞凋亡,在凋亡检测中极具前景，是凋亡细胞的一个早期反应。线粒体结构和功能障碍是各种刺激因素诱导细胞凋亡的中心事件，单抗能与线粒体膜蛋白特异性结合，并由此导致线粒体内凋亡因子释放，参与细胞凋亡的调控。Apo2.7参与该调节，与Bcl-2密切相关。

本研究显示，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的表达与细胞凋亡率亦存在相关性，通过Bcl-2的高表达及Caspase-3和Apo2.7基因的表达下调，使细胞凋亡过程受到抑制，细胞凋亡率呈趋势性下降，细胞凋亡与增殖比例失调可致癌变概率增大，这与刘爱群等[12]或杨静等[13]通过免疫组化方法检测胃病变组织中Bcl-2及Caspase-3的研究结果一致。同时本研究也发现，Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的免疫组化阳性率进展与流式细胞表达率趋势一致，Bcl-2阳性率渐行性增高，Caspase-3和Apo2.7渐行性降低，其蛋白表达阳性程度亦与其阳性率趋势相符。流式细胞术检测各指标可在胃黏膜病变中全程量化，而免疫组化染色各指标只能半定量监测，各病变期仍存在阴性标本，特异性不足，体现了流式细胞术相对于免疫组化方法在临床应用中的一大优势。

本研究资料显示了在胃癌变过程中，细胞凋亡率、Bcl-2、Caspase-3及Apo2.7的量变关系，通过分析其变化趋势可对胃癌的早期诊断及病程监测提供参考，亦说明了细胞凋亡调控在胃黏膜细胞异常增殖及癌变过程中所起的作用。监测细胞凋亡率以及Bcl-2、Caspase-3、Apo2.7在胃黏膜组织中的定量表达情况，可推断其疾病进展情况。