解淀粉芽胞杆菌Jt84防治水稻稻曲病田间应用技术研究

张荣胜，于俊杰，齐中强，张 浩，杜 艳，俞咪娜，宋天巧，曹慧娟，潘夏艳，雍明丽，陈志谊，刘永锋

（江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014）

稻曲病是由半知菌亚门稻绿核菌（Ustilaginoideaoryza，无性态）、子囊菌亚门稻麦角菌（Claviceps virens，有性态）侵染为害引起的，在世界上水稻的主要产区均有发生，是水稻生产中的一种重要真菌病害[1,2]。近年来随着我国水稻品种更替和栽培方式的改变，稻曲病的发生呈现出加重的趋势；稻曲病的发生和流行与气候、品种、栽培及肥水管理密切相关，在不同年度间和地区间，以及品种间发生为害差异大；稻曲病在低温高湿的环境下，发病尤为严重，一般可造成20%～30%的产量损失，严重时可减产50%以上[1-4]。稻曲病菌形成稻曲球过程中，会产生毒素，对稻米品质产生严重影响[1,5-7]。目前生产上防治以化学农药为主，主要是三唑类杀菌剂，化学药剂的过量使用易使病原菌产生抗药性，导致药剂防效降低，同时造成稻谷上农药残留超标；长期过量使用化学农药也对生态环境造成严重污染。因此，利用有益微生物来防治水稻稻曲病具有广阔的应用前景[8,9]。

解淀粉芽胞杆菌是一类好氧、能够产芽胞的革兰氏阳性杆状细菌，广泛分布在土壤、水体、植物表面、植物根际等生境的环境友好型微生物；芽胞杆菌能够通过分泌抗菌物质、营养和空间竞争、诱导植物产生抗病性等多种机制来防治植物病害[10-14]。尹小乐等[15]分离出2株对稻曲病菌菌丝具有强抑制作用的枯草芽胞杆菌SF-62和SF-3-38，田间试验结果显示防效分别为47.9%和43.1%；李晶等[16]分离获得1株短小芽胞杆菌ZHQN-6，对稻曲病菌菌丝生长抑菌率和孢子萌发率分别为50.76%和74.85%；沙月霞等[17]发现贝莱斯芽胞杆菌E69对稻瘟病具有显著的预防效果；朱哲远等[18]研究发现1株蜡质芽胞杆菌B-7对稻曲病菌抑菌活性为72%，田间防效为63.9%。江苏省农业科学院筛选获得一株解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciensJt84对水稻稻曲病具有良好防效。本文针对生防菌Jt84在水稻叶表的定殖规律、防治水稻稻曲病最佳时期和田间使用量等方面开展研究，以期为生防菌Jt84的高效应用和开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试水稻品种：南粳9108。

供试菌株：解淀粉芽胞杆菌Jt84，由江苏省农业科学院植物保护研究所水稻病害研究室提供。生防菌Jt84菌株用YPG培养基（胰蛋白胨5.0 g，葡萄糖5.0 g，酵母膏5.0 g，补水至1000 mL，pH 7.0，固体培养基（YPGA）在以上成分基础上加入15.0～17.0 g琼脂粉）培养。

供试药剂：13%井冈霉素水剂，浙江省桐庐汇丰生物科技有限公司。

1.2 生防菌Jt84菌液制备

从保存菌株Jt84的试管中用接种环挑取一环在YPGA斜面上进行活化，放置于培养箱中28 ℃～30 ℃培养24～48 h，得到新鲜活化的Jt84菌株；然后挑取一环转接到YPG培养液（330 mL/1000 mL三角瓶）中，在30 ℃、150 r/min条件下培养48 h，获得的发酵液中菌体含量为6.0×108cfu/mL。

发酵工艺流程：菌株Jt84斜面移殖活化（YPGA 培养基），28 ℃培养24 h；摇瓶扩繁2000 mL YPG培养液，30 ℃、150 r/min 培养48 h；种子罐一级发酵2 t，34.0 ℃～35.0 ℃，培养8.5 h；大罐二级发酵10 t，36.0 ℃～39.0 ℃，培养18～20 h，发酵完成，此时菌体含量为1.0×1010cfu/mL；分装后生防菌Jt84菌体含量为4.0×109cfu/mL。

1.3 菌株Jt84gfp在水稻叶片上的定殖动态

感受态细胞制备方法参考文献[19,20]作适当修改，挑取Jt84单菌落接种于10 mL的GCHE培养基中，在37 ℃、200 r/min培养到OD600值约为0.5～0.8时，然后等量加入10 mL的GC培养基继续共培养1 h；将上述菌体以8000 r/min离心10 min后收集，悬浮于含0.5%葡萄糖的1 mL培养液中，分装保存即为感受态细胞。向0.2 mL感受态细胞中加入100 ng 标记荧光基因的穿梭质粒prp22-gfp，孵育20 min后加入YPG培养液，37 ℃、200 r/min继续培养90 min，最后将培养菌体涂布于含有氯霉素抗性的YPGA培养基上，挑选转化子，获得荧光标记的菌株Jt84gfp。将筛选获得的荧光标记菌株接种于YPG培养液中，在30 ℃、150 r/min条件下培养48 h，发酵后菌液于水稻三叶期喷施进行后续定殖试验。分别于喷施后0、1、3、5、7、9、16、21和30 d采集水稻叶片（长约5 cm叶段），用剪刀剪碎，放入试管，加入5 mL无菌水，30 ℃、200 r/min，振荡培养1 h，然后稀释为10-3、10-4、10-5和10-6，涂布在含5 μg/mL氯霉素的YPGA平板，统计菌落数；采集的叶片在光学显微镜下观察并拍照。

1.4 生防菌Jt84不同喷施时期对水稻稻曲病的防效测定

生防菌第一次用药时期分别为水稻“叶枕平（零叶枕距）”（剑叶叶枕与倒数第二叶叶枕处于同一水平）和“正叶枕距”（剑叶叶枕高于倒数第二叶叶枕3～5 cm）；第二次用药时期为水稻破口期。第二次喷施生防菌30 d后根据稻穗为害症状程度分级，计算防治效果。

1.5 生防菌Jt84防治稻曲病田间示范试验

田间小区试验于2019年在江苏省淮安区平桥镇张国平家庭农场中进行，水稻品种为南粳9108。小区面积为20 m2，每处理4次重复，小区随机排列。田间试验使用的Jt84发酵液由江苏省苏科农化有限公司发酵制成，菌体含量为4.0×109cfu/mL，生防菌Jt84用量为200、300和400 mL/667 m2，兑水20 L均匀喷雾；13%井冈霉素水剂田间用量为50 mL/667 m2，兑水20 L均匀喷雾。在水稻破口前5～7 d施药，间隔7～10 d左右进行第二次防治。调查方法：参照农业农村部药检所“NY/T 1464.54—2014农药田间药效试验准则第54部分：杀菌剂防治水稻稻曲病”的规定进行。每小区5点取样，每点选取200穗。根据稻穗为害症状程度分级，记录。分级标准参考张正炜等[3]计算病情指数和防效，0级：无病；1级：每穗 1个稻曲球；3级：每穗2个稻曲球；5级：每穗3～5个稻曲球；7级：每穗6～9个稻曲球；9级：每穗10个及以上稻曲球。病情指数＝∑（各级发病数×各级代表值）/（调查总穗数×最高级代表值）×100；防治效果（%）＝[（对照区病情指数—处理区药后病情指数）/对照区病情指数）]×100。

1.6 数据统计与分析

利用DPS 7.05软件Duncan’s新复极差法进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 解淀粉芽胞杆菌Jt84在水稻叶面的定殖规律

将携带gfp基因的载体导入生防菌株Jt84中，筛选获得发荧光的Jt84gfp菌株（图1）。将生防菌喷施于三叶期的水稻叶片上，回收后涂布于抗氯霉素抗性平板进行菌量检测。结果表明，喷雾初始菌体含量为6×108cfu/mL芽胞杆菌发酵液，2 h在水稻叶面定殖菌量为4×106cfu/cm2，随时间增加定殖生防菌数量缓慢降低；喷施后7～16 d检测到生防菌的菌量保持相对稳定，维持在104cfu/cm2；21 d后，检测到的生防菌数量明显降低，30 d时在叶片表面仍可检测到少量菌体，定殖量为22 cfu/cm2（图2）；将3和7 d采集的叶片进行荧光显微观察，发现菌株Jt84gfp在水稻叶表大量存在（图3），以上结果显示生防菌Jt84在水稻叶片表面可以有效定殖。

图1 荧光标记解淀粉芽胞杆菌Jt84gfpFig.1 Fluorescent labeling of B.amyloliquefaciens Jt84gfp

图2 荧光标记菌株Jt84gfp 在水稻叶面定殖动态Fig.2 Colonization dynamics of fluorescent-labeled Jt84gfp strain on rice leaves

图3 菌株Jt84gfp在水稻叶片上定殖的荧光显微观察（A：3 d；B：7 d）Fig.3 Fluorescence microscopic observation on the colonization of Jt84gfp strain on rice leaves (A: 3 d; B:7 d)

2.2 生防菌Jt84对水稻稻曲病最佳防治时期测定

由表1看出，生防菌Jt84在水稻“零叶枕距”和“正叶枕距”时期用药防治，盆栽试验结果显示：生防菌对稻曲病的防治效果分别为85.3%和76.5%，表明生防菌Jt84防治稻曲病的初次用药最佳防治时期为水稻叶枕平时期。

表1 生防菌Jt84不同防治时期对水稻稻曲病的防效测定Table 1 Determination of the control effect of strain Jt84 on rice false smut in different periods

2.3 生防菌Jt84对稻曲病的田间防治效果

解淀粉芽胞杆菌Jt84悬浮剂田间防治试验结果表明，解淀粉芽胞杆菌悬浮剂对水稻稻曲病具有良好的防治效果。解淀粉芽胞杆菌Jt84悬浮剂使用剂量为200～400 mL/667 m2时，田间防效为77.8%～89.5%；在生防菌Jt84用量为200 mL/667 m2时对水稻稻曲病的田间防效与13%井冈霉素水剂防效相当（表2）。结果表明解淀粉芽胞杆菌Jt84悬浮剂对水稻稻曲病具有显著防效，可以有效预防稻曲病菌对水稻的侵染。

表2 40亿芽胞/毫升解淀粉芽胞杆菌Jt84悬浮剂田间试验效果（江苏淮安）Table 2 Field trial effect of B.amyloliquefaciens Jt84 with 4.0×109 cfu/mL (Huai’an, Jiangsu Province)

3 讨论

本试验对生防菌Jt84在水稻叶表的定殖规律和田间应用技术进行研究，目的在于挖掘生防菌Jt84的生防潜力。生防菌发挥作用的前提在于其能在植物的叶围和根围有效定殖，而芽胞杆菌在植物根围或叶围生存主要以生物膜的形式存在，生物膜能提高芽胞杆菌的生存竞争力和抵御外界不良环境因素的影响，同时还能保证芽胞杆菌在植物根围或叶围的定殖种群数量，从而发挥有效的生防和促生作用[21,22]。Luisa等[23]研究表明枯草芽胞杆菌 EA-CB0575在香蕉和番茄根际都能够有效定殖，表现出一定的促生作用，但它们在不同植物根际分布模式存在不同；Priyanka等[24]获得芽胞杆菌Bacillussp.MT7表现出良好的生物膜形成能力，同时它能够在番茄根际大量定殖，显著促进植物生长。前期研究也发现生防菌Jt84形成生物膜的褶皱较明显，以及形成的生物膜较厚[25]；定殖规律结果显示，生防菌Jt84在16 d内数量维持在104cfu/cm2左右，表明其能在水稻叶表有效定殖，且在一定的时间范围内定殖量维持相对较高水平，是一株具有良好生防潜力的菌株。通过生防菌Jt84不同防治时期对稻曲病盆栽防治试验，结果显示在“零叶枕距”时期用药防治稻曲病防效显著高于“正叶枕距”时期（表1），这点与黄世文[2]研究结果一致。有研究表明稻曲病的侵染时期发生在水稻孕穗期，此时期在田间也检测到了稻曲病菌子囊孢子的存在[23]，我们推测生防菌在水稻叶枕平时期使用，通过在水稻叶表定殖，产生抗菌物质，有效抑制稻曲病菌孢子侵染水稻，延缓病害迅速蔓延。

研究表明芽胞杆菌可以产生对植物病原真菌具有抑菌活性的抗菌物质，主要为低分子量的抗生素如脂肽类、聚酮类、细菌素以及高分子量蛋白类抗菌物质等[11,13-14]；芽胞杆菌产生的脂肽类物质能激活植株体内防卫反应基因表达，诱导寄主植株产生ISR抵御病原菌入侵[26-28]。Farzand等[29]研究显示解淀粉芽胞杆菌 EZ1509对核盘菌具有良好的抑菌活性，其中起主要抗真菌活性物质是脂肽类抗生物。Rodríguez等[30]研究认为surfactin能够诱导花生产生系统抗病性，抵御花生白绢病菌的侵染；Paiboon等[31]也发现fengycin和iturin A诱导柑橘植株中防卫反应相关PAL，ACS1，ACO，CHI和GLU的基因表达。前期研究也表明，生防菌Jt84能够分泌3种脂肽类抗菌物质（surfactin、iturin和fengycin），推测生防菌Jt84同样诱导水稻产生ISR，对此还需进一步研究。本文研究显示，在田间应用生防菌Jt84防治水稻稻曲病，最适喷施期应在叶枕平时期，通过大量引入生防菌，利用生防菌占领侵染位点、分泌抗菌物质抑制病原菌生长繁殖等措施来减轻病原真菌对水稻的危害。田间试验也显示生防菌Jt84能够有效地防治水稻稻曲病，使用量在300～400 mL/667 m2时，防效显著高于13%井冈霉素水剂。后续将在前期基础上，对生防菌Jt84防治水稻稻曲病的防治机理进行深入研究，为生防芽胞杆菌防治稻曲病的田间高效应用提供理论依据。