基于网络药理学探讨柴胡治疗癫痫的作用机制*

卢玲，梁妮，廖现秋，李欢，李明芬，秦红玲，宋曦，刁丽梅

1.广西中医药大学，广西 南宁 530001； 2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023

癫痫(epilepsy，EP)是一种以发作性、短暂性、重复性和刻板性的中枢神经系统功能失常为特征的综合征[1]。癫痫发作可引起短暂性大脑功能障碍。该病治疗周期长，但长期服用抗癫痫药常伴有多种不良反应，且严重影响了患者的生活质量[2]。据统计，对抗癫痫药耐药的难治性癫痫患者约占癫痫患者总数的1/3[3]。中医在治疗癫痫方面历史悠久，能很好地控制癫痫患者的临床症状，有效减缓发作频率，提高患者依从性，减少抗癫痫药的不良反应[4]。现代研究及临床实践中发现中医药具有良好的抗癫痫效果[5]。

自古对于柴胡的应用甚广，中医认为柴胡性味苦寒，归属肝经、胆经、三焦经、心胞络，有解热、镇静、抗惊厥、抗癫痫、止痛、疏肝利胆、抗菌消炎等作用。现代药理学研究发现，其主要成分有柴胡皂苷、多糖等，且具有多种生物活性和药理作用[6]。柴胡中的柴胡皂苷可能通过减轻氧自由基的损伤程度，改善脑组织ATP酶的活性，从而起到抗惊厥和镇静作用，可缓解癫痫患者的抽搐、全身强直、凝视等症状[7]。然而，由于中药治疗疾病是多成分、多靶点的调节方式，使得柴胡治疗癫痫的作用机制并不明确。

网络药理学是一种基于大数据时代背景下的新兴学科，以疾病-基因-药物多层次网络为基础，融合了系统生物学、分子生物学、药理学以及多种网络计算平台等，能够从整体上预测药物靶点、提高药物发现效率[8]。中药通过多种活性成分及多种作用途径，起到治疗疾病的目的，其过程与网络药理学的研究过程不谋而合。何信用等[9]通过TCMSP数据库，利用网络药理学探讨黄连解毒汤治疗动脉粥样硬化的潜在分子机制。Huang等[10]通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)的相关研究，发现二至丸抗药物性肝损伤的可能机制。众多研究均表明，利用TCMSP数据库挖掘中药的活性化合物及其作用靶点，进行药物的作用机制研究具有可行性。因此，本研究通过网络药理学，构建“成分-靶点-通路-疾病”多维网络，探索柴胡治疗癫痫的作用机制，为柴胡的临床应用以及癫痫相关的基础与临床研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象TCMSP (http：//tcmspw.com/tcmsp.php)是中药系统药理学数据库和分析平台，本研究通过TCMSP检索获得柴胡的全部化合物，根据建议药物筛选标准，剔除其余不符合条件的化合物，得到其活性化合物数据。

1.2 研究工具从中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)中获得柴胡的成分、靶点、相互关系和靶点的基因信息。在线文本挖掘服务器GeneCards(https：//www.genecards.org/)和人类孟德尔遗传OMIM数据库(https：//omim.org/)中收集到与癫痫相关的靶基因。在线软件venny2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)分析得到柴胡与癫痫共同的靶点。STRING数据库构建PPI网络。Cytoscape 3.6.1软件构建“柴胡活性化合物-靶点”相互作用网络，并且对PPI网络进行可视化，CytoNCA 插件进行PPI网络拓扑分析筛选核心靶点。R语言软件(版本：v.3.5.0)的clusterProfiler包[11]对柴胡与癫痫的共同靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，进一步通过Cytoscape构建KEGG关系网络。

1.3 柴胡活性化合物的筛选生物利用度(oralbioavail-ability，OB)是口服药物的主要药代动力学参数，用来测量药物吸收进入血液循环系统的速度和程度[12]。类药性 (drug-likeness，DL)是预测化合物成为药物的可能性的定性原则，可用于药物开发，帮助优化药代动力学和药学特性[13]。本研究从TCMSP中检索获得柴胡的全部化合物，根据建议药物筛选标准：OB≥30%和DL≥0.18筛选出柴胡的活性化合物。

1.4 柴胡治疗癫痫的作用靶点筛选通过GeneCards数据库和OMIM数据库筛选出癫痫相关的靶点，剔除重复靶点，得到癫痫相关靶点数据。基于在线软件venny2.1.0对癫痫相关靶点和柴胡作用靶点取交集，获得柴胡和癫痫的共同靶点。

1.5 初步构建“化合物-靶点”网络Cytoscape可用于构建由蛋白质、基因、药物等相互作用构成的分子交互网络，实现生物网络可视化和数据集成[14]。将筛选出的化合物及靶点数据导入Cytoscape 3.6.1进行可视化分析，构建“柴胡活性化合物-癫痫靶点”关系网络。

1.6 通过蛋白互作网络的拓扑分析筛选核心靶点为了解靶点之间的相互作用关系，将柴胡和癫痫的共同靶点导入在线数据库STRING进行分析，得到蛋白相互作用关系网络(PPI网络)。并使用 Cytoscape 软件中 CytoNCA 插件筛选核心靶点，构建核心子网络，最后将PPI网络拓扑分析筛选的核心靶点与“柴胡活性化合物-癫痫靶点”关系网络进行综合分析，得到“柴胡活性化合物-癫痫靶点-PPI核心靶点”多维网络关系图。

1.7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析将柴胡与癫痫的共同靶点导入R语言软件进行GO和KEGG富集分析，该分析是基于clusterProfiler条件下进行的。clusterProfiler是Bioconductor的软件包，可以对基因集合或基因簇进行功能聚类的统计分析和可视化，其内部支持GO和KEGG[11]。本研究以Pvalue<0.05为筛选条件，选取符合条件的前20位KEGG信号通路及GO生物过程。

1.8 KEGG关系网络的构建把上述分析得到的KEGG信号通路数据进行编排，构建关系对文件，选取富集最显著的前20位KEGG通路进行网络的构建。并使用Cytoscape 进行可视化，计算出网络中各个节点的Degree值，并根据Degree值的大小调整节点的大小，以展示靶点与通路相关性的大小。

2 结果

2.1 柴胡中的活性化合物及靶点通过对柴胡的活性化合物筛选发现，柴胡中共有349个化合物，根据筛选条件：OB≥30%和DL≥0.18筛选出乙酸芳樟酯(linoleyl acetate)、黄芩苷(baicalin)、茵陈黄酮(areapillin)、山柰酚(kaempferol)、柴胡皂苷(saikosaponin c_qt)、槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)、异鼠李素(isorhamnetin)等17个活性化合物。这17个活性化合物共作用于166个靶点。柴胡活性化合物基本信息见表1，柴胡活性化合物作用的部分靶点见表2。

表1 柴胡活性化合物基本信息

表2 柴胡活性化合物作用的部分靶点基本信息

2.2 “柴胡活性化合物-癫痫靶点”关系网络构建利用GeneCards数据库和OMIM数据库对癫痫相关的编码基因进行查找，获得癫痫相关的靶点4 622个。基于在线软件venny2.1.0对柴胡的166个药物潜在靶点和癫痫的4 622个靶点取交集，得到108个共同的靶点，见图1。这108个靶点既是癫痫相关的靶点，也是柴胡治疗癫痫的作用靶点。将活性化合物及靶点数据导入Cytoscape 进行可视化分析，得到“柴胡活性化合物-癫痫靶点”网络图，其中浅蓝色部分代表药物和疾病的共同靶点，黄色部分代表药物活性化合物，见图2。

图1 柴胡化合物靶点与癫痫相关靶点韦恩图

注：图中浅蓝色代表柴胡和癫痫的108个共同靶点，黄色代表柴胡的17个活性化合物，红色代表癫痫，绿色代表柴胡图2 “柴胡活性化合物-癫痫靶点”网络图

2.3 PPI网络拓扑分析筛选核心靶点为了解靶点之间的作用关系，将共同靶点输入在线STRING数据库中，得到PPI网络图。结果表明，108个共同靶点之间均存在直接或间接的作用关系。同时使用CytoNCA插件进行拓扑结构分析，筛选出Degree值>61的靶点共12个，得到核心子网络图，见图3。筛选出的12个核心靶点与柴胡活性化合物对应关系见表3。再将PPI网络拓扑分析结果与前面得到的“化合物-靶点”网络进行综合分析，构建“柴胡活性化合物-癫痫靶点-PPI核心靶点”关系图，其中浅蓝色代表柴胡和癫痫的共同靶点，黄色代表柴胡活性化合物，粉色代表PPI网络拓扑分析的12个核心靶点，见图4。得到的AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9 12个核心靶点既受到柴胡活性化合物的调控，也与癫痫的发病密切相关。

表3 12个核心靶点基本信息

图3 12个核心靶点之间关系网络图

2.4 GO生物过程和KEGG通路富集分析在clusterProfiler包加载后，以Pvalue<0.05为筛选条件，将药物与疾病的共同靶点基因导入R语言软件中进行GO和KEGG分析。GO分析结果得到138个条目，再根据P值从小到大的顺序，选取前20个GO分析条目。其中主要包括类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、核受体的活动(nuclear receptor activity)、转录因子活性、直接配体调控序列特异性DNA结合(transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、细胞因子活性(cytokine activity)等生物分析过程，具体GO注释见图5。柴胡治疗癫痫作用靶点的KEGG通路富集分析结果共得到169条KEGG通路，同样按照P值从小到大的顺序筛选前20条，主要涉及糖尿病并发症的信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎通路(Hepatitis B)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)等，见图6。除了前20条通路之外，KEGG分析结果也表明药物与疾病的共同靶点基因在MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)和细胞凋亡通路(Apoptosis)等，癫痫发病相关的通路上也有显著富集。

注：图中浅蓝色代表柴胡和癫痫的108个共同靶点，黄色代表柴胡活性化合物，粉色代表12个核心靶点，红色代表癫痫，绿色代表柴胡图4 “柴胡活性化合物-癫痫靶点-PPI核心靶点”多维网络关系图

注：横坐标代表基因数，纵坐标代表GO条目，颜色越红代表p值越小图5 GO分析结果图

2.5 KEGG关系网络的构建将KEGG通路富集分析得到的前20条通路数据进行编排后导入Cytoscape 软件，根据Degree值的大小调整节点的大小，得到KEGG关系网络，见图7。其中共有84个节点，橙色部分代表前20个富集显著的通路，红色部分代表通路上富集的靶点基因，橙色节点越大代表通路上富集的靶点基因越多，红色节点越大代表靶点基因参与的通路越多。上述PPI网络拓扑分析得到的AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9 12个核心靶点，也在KEGG关系网络中表现出显著的相关性。结果表明，柴胡的各活性化合物是通过多靶点、多信号通路共同发挥治疗癫痫的作用。

注：横坐标代表基因数，纵坐标代表通路名称，颜色越红代表p值越小图6 KEGG通路分析结果图

注：橙色代表通路，红色代表靶点基因，橙色节点越大代表通路上富集的靶点基因越多，红色节点越大代表靶点基因参与的通路越多图7 KEGG关系网络图

3 讨论

癫痫即中医所说的“痫病”，其发病通常涉及肝、脾、心、肾等脏腑。遗传因素、劳作过度、起居失调、情志内伤、脑部疾患皆可发为本病。柴胡具有抗惊厥、抗癫痫等作用。现代基础研究表明，柴胡中的活性化合物柴胡皂苷具有抗惊厥、抗癫痫、抗炎等多种药理活性，能减缓病变神经元的兴奋性，具有抑制癫痫发作，保护神经元的作用[15]。临床上，柴胡常应用于治疗癫痫，然而其作用机制尚不明确。本研究基于网络药理学，通过对柴胡的活性化合物、靶点进行分析，发现不同的药物成分可同时作用于多个靶点，初步揭示了柴胡治疗癫痫的可能作用机制。

网络分析结果显示，柴胡中的活性化合物主要含有黄芩苷、山柰酚、柴胡皂苷、槲皮素、异鼠李素、茵陈黄酮等，其均与癫痫的发生密切相关。有研究表明，黄芩苷可以明显减轻癫痫发作所致的神经元丢失，减轻海马脂质过氧化、亚硝酸盐含量和还原型谷胱甘肽水平的变化，具有显著的抗惊厥和神经保护作用[16]。黄芩苷可能通过下调miR-497的表达，裂解caspase-3蛋白和上调Bcl-2的表达，进而降低癫痫后海马神经元的损伤和凋亡，具有较强的抗凋亡作用[17]。柴胡皂苷A能抑制4种动作电位诱发的痫样放电，选择性地增加瞬间失活K+电流，从而减弱海马神经元中的自发反复癫痫样放电，起到抗癫痫作用[18]。Mazumder等[19]在银杏叶提取物的研究中提取出了山柰酚、槲皮素和银杏叶总黄酮等，并且其可通过抑制mTOR通路的过度激活，对癫痫起保护作用。本研究从柴胡中筛选的活性化合物：山柰酚、槲皮素和异鼠李素均属于黄酮类化合物[20]。研究表明，在中枢神经系统(CNS)中，黄酮类化合物与GABA受体上的苯二氮卓类药物结合，可以保护大脑免受氧化应激的伤害，具有抗惊厥作用，对癫痫有潜在的神经保护作用[21]，这为进一步深入探讨柴胡治疗癫痫的作用机制奠定了良好的基础。

PPI网络核心靶点和KEGG关系网络分析均显示，柴胡中的活性化合物可能是通过AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、JUN、EGF、EGFR、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MYC、MMP9等靶点起作用。VEGF在多种神经病理过程中发挥重要作用，既往研究在耐药性颞叶癫痫患者颞叶新皮质中发现VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C及其受体蛋白表达均增加，提示血管内皮生长因子系统在耐药性颞叶癫痫的发病机制中起着重要的作用[22]。在动物实验研究中发现，通过抑制PTGS2的表达，能够有效缓解癫痫发作[23]。同样，细胞因子也在癫痫的病理生理过程中扮演着重要的角色。在颞叶癫痫患者中炎性细胞因子血清IL-6水平明显升高[24]。因此，癫痫的发生与血管内皮因子、白细胞介素、表皮生长因子以及PTGS2的表达均密切相关。充分证明了柴胡治疗癫痫是多分子、多靶点、多途径相互作用的结果。

GO分析结果主要涉及类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、核受体的活动(nuclear receptor activity)、细胞因子活性(cytokine activity)、激酶调节活性(kinase regulator activity)等过程。KEGG通路分析结果显示，相关靶点显著富集在流体剪切应力和动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、HIF-1信号通路(HIF-1 signaling pathway)、C型凝集素受体信号通路(C-type lectin receptor signaling pathway)等。促炎因子 IL-17 的分泌失衡是药物难治性癫痫患者重要的免疫特征，IL-17具有增加血脑屏障的通透性和神经元兴奋性的作用，这提示癫痫发作可能是由 IL-17 细胞因子的促炎作用引起的，促炎性IL-17信号通路在难治性癫痫免疫组学结构中起着主导作用[25]。研究证实，HIF-1α因子和HIF-1α信号通路相关的多个基因集下调与胶质母细胞瘤的致痫密切相关[26]。C型凝集素家族中的四联素(Tetranectin，TN)是一种分泌型同源三聚体蛋白，被证实与多发性硬化和癫痫等多种神经系统疾病密切相关[27]。除了图6中展示的前20条通路之外，共同靶点还富集在MAPK信号通路和细胞凋亡通路等与癫痫相关的信号通路上。研究认为，miRNA-129可能通过抑制MAPK信号通路，从而抑制癫痫的发生发展[28]。凋亡和自噬信号通路则被认为是由癫痫发作触发的，都与癫痫反复发作后的神经元丢失有关[29]。综上，柴胡中的活性化合物可能通过参与上述通路，进而减轻炎症反应、抑制神经元细胞凋亡、减少神经损伤等，从而发挥抗癫痫的作用。进一步说明柴胡治疗癫痫是通过多种生物途径、多条信号通路共同起作用的。

本研究基于网络药理学探讨柴胡治疗癫痫的作用机制，结果表明，柴胡治疗癫痫是通过多成分、多靶点、多通路发挥作用，拓宽了柴胡临床应用的思路，也为中医药治疗癫痫提供了机制研究的思路。且本研究预测的活性化合物、靶点及通路与文献报道基本相一致，为本课题组进一步的实验验证提供了良好的方向。