甘草养阴汤对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞增殖和凋亡的影响*

陈永，邱富娟，陈艳娟，朱兴旺，刘永谱，余焙佳，肖长虹

1.南方医科大学中西医结合医院，广东 广州 510330； 2.暨南大学，广东 广州 510632

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是最常见的风湿科疾病，患病率高达0.5%～1.0%[1]。RA危害极大，其突出的病理特点是滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质，最终导致关节破坏甚至畸形[2]，临床表现为关节疼痛、变形和功能丧失，甚至累及人体多个系统、器官，引发并发间质性肺病、动脉粥样硬化心血管病、贫血等[3]。

研究表明，滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)是RA发病进程中关键的效应细胞[4]。RA患者的滑膜从静止的相对无细胞的结构转变为充满免疫细胞的增生性浸润组织。活化的FLS迅速增殖形成血管翳[5]，并且能抑制细胞凋亡，FLS通过产生炎症性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、趋化因子和基质降解分子等增强迁移能力，加速关节软骨的侵袭和破坏[6]。

目前RA的治疗药物包括糖皮质激素、改善风湿病情药物及生物制剂等[7]。近几十年来，RA病情控制虽然有了较大的提高，但仍存在难治性病例、耐药、药物副作用等挑战[8]。甘草养阴汤是张仲景《金匮要略》中“甘草泻心汤”改良而成的药食同源配方。原甘草泻心汤在白塞病(中医“狐惑病”)中研究广泛[9]，亦有对于RA等自身免疫性疾病的报道[10]，但原方中半夏具有小毒，黄连口感过于苦，改良后含有甘草、人参、罗汉果、蒲公英等药物，这些药物均出自国家卫计委公布的既是食品又是药品的中药名单[11]，配伍阴阳平和、滋阴扶阳。国内外大量研究证实，甘草[12]、人参[13]、蒲公英[14]等均具有抗炎、抗氧化、甚至抑制癌细胞增殖的作用，而RA-FLS分泌炎症因子并具有侵袭性被认为具有癌细胞的特性[15]，推测甘草养阴汤可能对RA-FLS的增殖有一定影响。基于此，本研究通过体外实验观察甘草养阴汤对RA-FLS细胞增殖及凋亡的影响，为甘草养阴汤治疗RA提供参考。

1 材料

1.1 动物SPF级雌性SD大鼠20只，6周龄，体质量180～220 g，购自南方医科大学动物实验中心，生产许可证号：SCXK(粤)2016-0041。温度22～24 ℃，湿度30～60%条件饲养，自由饮食。

1.2 药品与试剂甘草养阴汤(自备，专利号：201910843519.9)。1640培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：31870082)；胎牛血清、青霉素-链霉素双抗溶液(美国ThermoFisher公司，货号：10099、SV30010)；胶原酶、磷酸缓冲盐溶液、D-Hanks液、胰酶(美国Sigma-Aldrich公司，货号：C2674、D8537、H6648、R001100)；舒泰50(法国Virbac公司，规格：50 mg，批号：86ZBA)；MTT细胞增殖分析检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天公司，货号：C0009、C1062S、C1052)。

1.3 仪器3311型培养箱、ST40型离心机、51119600C型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；FACS Canto II流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)；DW-FL450型冰箱(长虹美菱股份有限公司)。

2 方法

2.1 FLS细胞分离和培养通过关节镜滑膜切除术获得3例RA患者的滑膜组织标本。患者均为女性，诊断符合1987年美国风湿病协会(American college of rheumatology，ACR)分类诊断标准[16]，已排除感染、结核、肿瘤、糖尿病及其他免疫相关疾病。患者被安排用于治疗目的的膝关节内窥镜手术，并书面同意捐赠滑膜组织用于研究。

无菌条件下剪碎滑膜组织，加入含质量浓度为4.0 g·L-1胶原酶的1640 培养基7 mL，于37 ℃、5%CO2培养箱孵育消化4 h，300×g离心5 min，收集细胞，加入含10%胎牛血清及10 g·L-1青霉素-链霉素双抗的1640培养基，于37 ℃、5%CO2孵育箱中继续培养，18 h后细胞贴壁。PBS洗涤，弃除未贴壁细胞，继续培养18 h。贴壁细胞用D-Hanks液彻底冲洗后，用2.5 kg·L-1胰酶消化液消化，收集贴壁细胞，经流式细胞仪鉴定FLS纯度达98%以上。FLS在含10%胎牛血清的培养基中培养，传4～7代的细胞用于实验研究。

2.2 含药血清的制备将大鼠随机分为2组，即生理盐水对照组(normal saline，NS)和甘草养阴汤实验组(gancao nurish Yin decortion，GC)，每组10只。GC组采用甘草养阴汤灌胃[用量：3.78 g(饮片当量)/kg(大鼠体质量)，相当于60 kg成人用量的6.3倍]，每日2次，连续灌胃7 d，NS组采用等量生理盐水灌胃。灌胃完成2 h后，舒泰50肌肉注射进行麻醉，腹主动脉采血。4 ℃冰箱静置1 h，300×g离心8 min分离血清，56 ℃水浴30 min灭活并过滤除菌后，加入终浓度为10 g·L-1青霉素-链霉素双抗，分装入离心管，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

2.3 细胞增殖实验收集对数期FLS，调整细胞悬液浓度为1×106mL-1，96孔板中每孔加入100 μL，37 ℃、5%CO2培养箱孵育18 h后细胞贴壁，弃上清。NS组加入100 μL含10%NS组大鼠血清的1640 培养基，GC组加入100 μL含10%GC组大鼠血清的1640培养基，分别于培养0 h、24 h、48 h、72 h 后采用MTT法检测FLS细胞增殖情况。实验操作按MTT细胞增殖分析检测试剂盒说明书进行，采用酶标仪于490 nm波长处检测每个实验孔的OD值。

2.4 细胞凋亡实验取对数期FLS，调整细胞悬液浓度为1×106mL-1，6孔板中每孔加入2 mL。37 ℃、5%CO2培养箱孵育18 h后贴壁，弃上清。NS组加入100 μL含10% NS组大鼠血清的1640 培养基，GC组加入100 μL含10%GC组大鼠血清的1640 培养基，培养48 h后，胰酶消化，收集细胞，PBS清洗2次，300×g离心5 min，收集细胞。采用流式细胞仪按Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作检测细胞凋亡率。

2.5 细胞周期检测按照2.4项下的方法准备2组细胞，PBS洗涤离心后加入2 mL预冷75%酒精，4 ℃固定2 h，PBS重悬，洗涤1次。采用流式细胞仪按细胞周期检测试剂盒说明书操作，分析两组FLS的细胞周期。

3 结果

3.1 甘草养阴汤对FLS细胞增殖的影响与NS组比较，含药血清干预48h时后，GC组OD值显著降低(P<0.05)，含药血清干预72 h后，GC组OD值极显著性降低(P<0.001)。提示甘草养阴汤能显著抑制FLS细胞增殖。见图1。

3.2 甘草养阴汤对FLS细胞凋亡的影响流式细胞术检测显示，与NS组比较，GC组FLS细胞凋亡率显著升高(P<0.01)。提示甘草养阴汤能显著促进FLS凋亡。见图2。

注：NS：生理盐水血清组，GC：甘草养阴汤血清组；与NS组比较，*P<0.05，***P<0.001图1 甘草养阴汤对FLS细胞增殖的影响

注：NS：生理盐水血清组，GC：甘草养阴汤血清组；与NS组比较，**P<0.01图2 甘草养阴汤对FLS细胞凋亡的影响

3.3 甘草养阴汤对FLS细胞周期的影响流式细胞技术检测显示，与NS组比较，GC组G0/G1期细胞百分比显著升高(P<0.001)，而S期细胞百分比、G2/M期细胞百分比显著降低(P<0.000 1，P<0.01)。见表1。

表1 甘草养阴汤对FLS细胞周期影响

4 讨论

RA是一种以关节滑膜炎症为病理机制的自身免疫病，滑膜增生并侵蚀关节软骨和骨质，最终导致关节破坏甚至畸形[17]。生理状态下，滑膜产生的透明黏性滑液，可减少运动过程中关节软骨之间的摩擦，为周围软骨提供结构支持和必要的营养供应，从而维持关节功能[18]。FLS是间充质来源的细胞，是滑液主要成分的主要来源细胞，可分泌透明质酸等糖蛋白[19]，尤其是润滑素(lubricin)，是对关节润滑至关重要的一种蛋白[20]。此外，FLS表达许多介导细胞黏附的重要分子，例如钙粘蛋白-11(cadherin-11)、血管细胞黏附蛋白(vascular cell adhesion molecular，VCAM)-1和各种整联蛋白及其受体[21]。但在RA患者的滑膜中，FLS可以产生许多促炎信号分子，特别是白细胞介素-6(interlukin-6，IL-6)、IL-8、前列腺素和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)，参与炎症反应并直接影响其它炎症细胞[4]，这些病理过程可通过血小板微泡分泌的IL-1促进FLS活化[22]。在FLS增殖和凋亡的过程中，RA-FLS明显增生，导致与其它炎症细胞，包括特异性和非特异性免疫细胞以及血小板一起在滑膜中产生炎症，并将更多的免疫细胞募集到受损部位(滑膜)，形成炎症反应的正反馈调节，进一步促成关节破坏。可见，RA-FLS大量增生并伴随炎症细胞浸润和新生血管形成是滑膜增生的基础[23]。

甘草养阴汤是在东汉末年张仲景《金匮要略》的“甘草泻心汤”基础上改良而成。原方在临床中运用广泛，包括消化系统如溃疡性结肠炎、消化性胃溃疡，神经系统如神经官能症，免疫系统包括白塞病[24]、TA、内分泌系统及妇科疾病[25]。但原方中半夏具有小毒，黄连口感过于苦，所以对原方的相关中药进行改良。中医治疗疾病讲究辨证论治，临床上RA包括寒湿痹阻证、湿热痹阻证、肾气虚寒证、肝肾阴虚证及瘀血痹阻证等多种证型[26]。按照中医思维，甘草养阴汤恐难以达到辨证论治的目的，但是甘草、人参、罗汉果、蒲公英等配伍阴阳平和、滋阴扶阳，形成对阴阳的缓冲，可适合多数RA人群。另外，由于RA是系统性疾病，加之西药的运用，常存在贫血、体力下降等并发症[27-29]，而人参等具有增强患者体力的补益功效[30-31]。

抑制FLS增殖是RA治疗的关键靶点。细胞周期的变化是影响细胞增殖与凋亡的关键因素，在细胞周期中，G0/G1期进行RNA和核糖体及复制所需酶的合成，S期进行DNA合成，G2/M期进行RNA和蛋白质的大量合成，并完成细胞分裂[30-31]。本研究发现，甘草养阴汤促使G2/M期和S期的FLS细胞比例明显减少，而G0/G1期细胞明显增加，进一步证实了甘草养阴汤对细胞增殖和凋亡的影响。

综合以上研究发现，甘草养阴汤含药血清能够抑制RA-FLS的增殖，并在一定程度上促进凋亡。本研究尚存在不足之处，要进一步建立RA动物模型进行相关疗效的考察。