黄芩苷介导Nrf2/HO-1通路的激活增强丙泊酚对肾缺血再灌注损伤大鼠的保护作用*

李前辉，张宜林，谢小娟，郭浩翔，王翔宇

河南科技大学第一附属医院，河南 洛阳 471023

肾脏是高度灌注的器官，对缺血非常敏感，缺血再灌注损伤是导致各种临床环境下急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)的主要原因，如肾移植、心血管外科、低血容量和脓毒性休克[1]。由于肾小管上皮细胞损伤、内皮功能障碍及异常修复，AKI可能发展为慢性肾脏疾病[2-3]。缺血再灌注损伤是一种病理现象，其中肾脏组织和细胞损伤是由于血液再灌注后的缺血加重引起的，是导致肾功能衰竭和预后不良的关键因素[4-5]。到目前为止，尚未确定对肾脏缺血再灌注损伤(renal ischemia-reperfusion injury，RIRI)的确切治疗方法，因此研究减轻RIRI引起的损害的策略至关重要[6]。

黄芩苷(baicalin，BAI)是提取自唇形科植物黄芩干燥根的一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等作用[7-10]。研究表明，BAI通过下调TLR2/TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达，抑制炎症和细胞凋亡而改善RIRI[11]。丙泊酚(propofol，Prof)通过降低CXCR4蛋白表达改变血管舒缩性减轻RIRI[12]。目前还未见BAI联合Prof对RIRI研究的相关报道，本文旨在探究BAI联合Prof对RIRI大鼠的影响。

1 材料

1.1 动物60只雄性SPF级SD大鼠，6～8周龄，体质量(200±20)g，购自浙江中医药大学动物实验研究中心，许可证号：SCXK(浙)2018-0003。饲养于12 h/12 h明暗交替、温度23～25 ℃、湿度45%～55%的条件。

1.2 药物与试剂BAI(纯度≥95.4%，中国食品药品检定研究院，批号：110715-201821)；Prof(纯度≥99.9%，中国食品药品检定研究院，批号：100806-20180)。戊巴比妥钠、ML385(美国Sigma公司，批号分别为：4390-14-3、SML1833)；苏木素-伊红染液、肌酐(serum creatinine，Scr)试剂盒、尿素氮 (blood urea nitrogen，BUN)测试盒、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所，货号分别为：D006-1-1、C011-2-1、C013-2-1、A001-3-2、A003-1-2)；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、40 ng·L-1多聚甲醛、BCA蛋白浓度测定试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗人IgG、极超敏ECL化学发光试剂盒(上海碧云天生物技术研究所，货号分别为：C1091、P0099、P0012、A0208、P0018FM)；Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1抗体(美国Abcam公司，货号分别为：ab31163、ab137550、ab13243、ab34173)。

1.3 仪器BS-280型全自动生化分析仪(南京贝登医疗股份有限公司)；DM750型荧光显微镜(德国Leica公司)；Varioskan LUX型多功能酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；U-T6A型紫外可见分光光度计(上海屹谱仪器制造有限公司)。

2 方法

2.1 动物模型建立与分组按随机数字表法将大鼠分为5组：Sham组、BAI组、RIRI组、RIRI+Prof组和RIRI+Prof+BAI组，每组12只。腹腔注射2%戊巴比妥钠(50 mg·kg-1)麻醉所有大鼠，对所有大鼠进行中线剖腹和右肾切除术，暴露左肾，用非创伤性血管钳夹紧左肾动脉，诱导缺血1 h，松开动脉后，再灌注24 h，Sham组和BAI组仅暴露左肾。当观察到肾表面颜色从暗紫色变化为血色时，表明血流恢复，RIRI模型制备成功[12]。BAI组灌胃黄芩苷30 mg·kg-1[13]，RIRI+Prof组灌胃丙泊酚50 mg·kg-1[14]，RIRI+Prof+BAI组同时灌胃黄芩苷30 mg·kg-1和丙泊酚 50 mg·kg-1，Sham组和RIRI组灌胃等体积生理盐水，连续给药 7 d。

2.2 检测大鼠肾功能指标收集各组大鼠尿液、血液，用全自动生化分析仪检测尿液中蛋白质含量，离心后的上清液用全自动生化分析仪检测Scr、BUN水平。

2.3 检测大鼠血清氧化应激指标取大鼠血清，按试剂盒说明书测定SOD活力、MDA含量。

2.4 HE染色观察大鼠肾脏损伤情况每组随机选3只大鼠，取肾脏，先用40 ng·L-1多聚甲醛固定48 h，然后石蜡包埋制作呈切片，切片5 μm厚，用苏木精、伊红染色。在显微镜下观察肾组织病理损伤变化。

2.5 TUNEL染色检测肾脏的细胞凋亡将HE染色的大鼠肾组织切片用二甲苯浸洗2次脱蜡，每次5 min，梯度乙醇脱水；用蛋白酶K工作液在 37 ℃ 下封闭20 min，PBS清洗2次；在每个切片样本上加入50 μL TUNEL反应液，37 ℃避光反应 60 min；用DAPI复染10 min在后荧光显微镜下进行观察。

2.6 Western blot法检测大鼠肾脏相关蛋白表达每组随机选3只大鼠，取肾组织，提取总蛋白并测定其含量；SDS-PAGE凝胶电泳法分离并转移至PVDF膜，在4 ℃下加入相应一抗并孵育过夜，清洗，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育2 h，最后加入ECL发光液，曝光处理。Image J软件统计灰度值。

2.7 加入Nrf2/HO-1通路抑制剂ML385后BAI联合Prof对RIRI大鼠的影响模型建立方法同2.1，将大鼠随机分为6组：Sham组、RIRI组、RIRI+Prof组、RIRI+Prof+BAI组、RIRI+Prof+ML385组和RIRI+Prof+BAI+ML385组。Western blot法检测大鼠肾组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达；TUNEL染色检测大鼠肾细胞凋亡；检测大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA、SOD含量。

3 结果

3.1 BAI联合Prof对RIRI大鼠BUN、Scr水平及肾脏病理损伤的影响大鼠尿液中BUN、Scr水平结果见图1A、1B，与Sham组比较，RIRI组大鼠尿液BUN、Scr水平显著升高(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠尿液BUN、Scr水平明显降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠尿液BUN、Scr水平显著降低(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠尿液BUN、Scr水平明显降低(P<0.05)。大鼠肾组织病理损伤程度结果见图1C，Sham组及BAI组大鼠肾组织结构完整，肾间质无水肿充血；RIRI组大鼠肾组织可见明显肾缺血再灌注损伤，肾小球体积增大、系膜增生，间质区可见淋巴细胞浸润，肾小球细胞呈空泡变性；RIRI+Prof组和RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织较RIRI组病理损伤程度明显改善。

注：与Sham组比较，**P<0.01；与RIRI组比较，#P<0.05，##P<0.01；与RIRI+Prof组比较，& P<0.05图1 BAI联合Prof对RIRI大鼠BUN、Scr水平和肾脏病理损伤的影响

3.2 BAI联合Prof对RIRI大鼠血清SOD、MDA含量的影响大鼠血清SOD、MDA含量结果见图2A、2B，与Sham组比较，RIRI组大鼠血清SOD活力显著降低(P<0.01)，MDA含量显著升高(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠血清SOD活力明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠血清SOD活力显著升高(P<0.01)，MDA含量显著降低(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠血清SOD活力明显升高(P<0.05)，MDA含量明显降低(P<0.05)。

3.3 BAI联合Prof对RIRI大鼠肾组织细胞凋亡的影响大鼠肾细胞凋亡结果见图3A、3B，与Sham组比较，RIRI组大鼠肾组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠肾组织细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾细胞凋亡率显著降低(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。大鼠肾组织Bax、Bcl-2蛋白表达结果见图3C、3D，与Sham组比较，RIRI组大鼠肾组织Bcl-2/Bax水平显著降低(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠肾组织Bcl-2/Bax水平明显升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织Bcl-2/Bax水平显著升高(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织Bcl-2/Bax水平明显升高(P<0.05)。

注：与Sham组比较，**P<0.01；与RIRI组比较，#P<0.05，##P<0.01；与RIRI+Prof组比较，& P<0.05图2 BAI联合Prof对RIRI大鼠SOD、MDA含量的影响

注：与Sham组比较，**P<0.01；与RIRI组比较，#P<0.05，##P<0.01；与RIRI+Prof组比较，& P<0.05图3 BAI联合Prof对RIRI大鼠肾组织细胞凋亡的影响

3.4 BAI联合Prof对RIRI大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响大鼠肾组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达见图4，与Sham组比较，RIRI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达显著降低(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达明显升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达显著升高(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达明显升高(P<0.05)。

注：与Sham组比较，**P<0.01；与RIRI组比较，#P<0.05，##P<0.01；与RIRI+Prof组比较，& P<0.05图4 BAI联合Prof对RIRI大鼠肾组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达的影响

3.5 加入Nrf2/HO-1通路抑制剂ML385后BAI联合Prof对RIRI大鼠的影响大鼠肾组织Nrf2、p-Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达结果见图5A、5B，与Sham组比较，RIRI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达显著降低(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组、RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平、HO-1、NQO1蛋白表达显著升高(P<0.01;P<0.05)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平、HO-1、NQO1蛋白表达明显升高(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385组p-Nrf2/Nrf2水平和HO-1、NQO1蛋白表达明显降低(P<0.05)；与RIRI+Prof+ML385组比较，RIRI+Prof+BAI+ML385组大鼠肾组织p-Nrf2/Nrf2水平、NO-1、NQO1蛋白表达明显升高(P<0.05)。大鼠肾细胞凋亡结果见图5C、5D，与Sham组比较，RIRI组大鼠肾组织细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠肾组织细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)；与RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠肾组织细胞凋亡率明显降低(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与RIRI+Prof+ML385组比较，RIRI+Prof+BAI+ML385组大鼠肾脏凋亡率明显降低(P<0.05)。大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA、SOD含量结果见图5E、5F、5G、5H，与Sham组比较，RIRI组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量显著升高(P<0.01)，血清SOD活力显著降低(P<0.01)；与RIRI组比较，RIRI+Prof组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明显降低(P<0.05)，血清SOD活力明显升高(P<0.05)，RIRI+Prof+BAI组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量显著降低(P<0.01)，血清SOD活力显著升高(P<0.01)；与 RIRI+Prof组比较，RIRI+Prof+BAI组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明显降低(P<0.05)，血清SOD活力明显升高(P<0.05)，RIRI+Prof+ML385组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明显升高(P<0.05)，血清SOD活力明显降低(P<0.05)；与RIRI+Prof+ML385组比较，RIRI+Prof+BAI+ML385组大鼠尿液BUN、Scr水平和血清MDA含量明显降低(P<0.05)，血清SOD活力明显升高(P<0.05)。

注：与Sham组比较，**P<0.01；与RIRI组比较，#P<0.05，##P<0.01；与RIRI+Prof组比较，& P<0.05；与RIRI+Prof+MB85组比较，△P<0.05图5 加入Nrf2/HO-1通路抑制剂ML385后BAI联合Prof对RIRI大鼠的影响

4 讨论

由于缺血再灌注引起的肾小管损伤，尿素和Scr会重新进入血流，导致血清氮水平升高。因此，评估血清中尿素和肌酐可间接反应肾功能损伤的情况[15]。BUN、Scr水平显著升高提示存在严重的肾功能损伤。刘甦等[16]研究发现，Prof通过降低BUN及Scr水平对RIRI大鼠有保护作用。本研究发现，BAI联合Prof可降低RIRI大鼠BUN、Scr水平，改善大鼠肾组织病理损伤程度。提示BAI联合Brof改善RIRI肾功能损伤。

当机体发生缺血再灌注损伤时，自由基、活性氧的过度堆积以及机体抗氧化能力的减弱，诱导发生氧化应激，加重RIRI[17-18]。SOD、MDA是氧化应激的重要指标。研究表明，SOD可拮抗氧化应激，与氧化应激水平呈负相关[19-20]。由于肾脏细胞膜破裂，MDA含量在肾脏缺血再灌注过程中增加[21]。本研究发现，BAI联合Prof可升高RIRI大鼠SOD活力，降低MDA含量。提示BAI联合Prof通过抗氧化应激改善RIRI。

细胞凋亡是一种由多种基因调控的自主程序性死亡，在RIRI病理生理过程中发挥重要作用，抑制细胞凋亡是治疗RIRI的方法之一[22]。Bax和 Bcl-2 属于Bcl-2基因家族成员，Bcl-2为凋亡抑制基因，Bax为促凋亡基因，Bax/Bcl-2水平越高，凋亡状况越严重[23-24]。李锦等[25]研究发现，Prof通过抑制促凋亡蛋白Bax表达对RIRI引起的细胞凋亡具有保护作用。任应国等[26]研究发现，BAI可上调自身免疫脑脊髓炎小鼠Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达。本研究发现，BAI联合Prof可升高RIRI大鼠肾组织Bcl-2/Bax水平。提示BAI联合Prof抑制RIRI大鼠肾细胞凋亡。

Nrf2是调节机体抗氧化应激水平的重要基因，而HO-1作为一种抗氧化酶可以维持应激状态下细胞的稳定性，发挥抗氧化作用[27]。当机体受到氧化应激损伤时，激活Nrf2可结合抗氧化反应元件上调HO-1的表达，从而提高机体抗氧化应激的能力[28]。当肾脏发生缺血再灌注时，激活Nrf2/HO-1通路对肾脏起到明显保护作用[29-30]。本研究发现，BAI联合Prof可升高RIRI大鼠p-Nrf2/Nrf2水平，上调HO-1、NQO1蛋白表达。提示BAI联合Prof通过激活Nrf2/HO-1通路保护RIRI大鼠，加入Nrf2/HO-1通路抑制剂ML385后则逆转这些效应证实了这一点。

综上所述，黄芩苷联合丙泊酚能减轻肾缺血再灌注损伤大鼠的肾组织病理损伤，其机制可能与抗氧化应激、抑制肾细胞凋亡、激活Nrf2/HO-1通路有关。