基于衍生化反应的母乳低聚糖质谱检测方法的建立

童文烽，杨国良，叶文慧，赖世云，任一平*，李 铎*

（1浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058 2浙江清华长三角研究院 浙江嘉兴 314006 3内蒙古伊利实业集团股份有限公司 呼和浩特 010110）

母乳是公认的新生儿的最佳营养来源，含有大量难以被消化的母乳低聚糖（Human milk oligosaccharides，HMOs），它们是母乳中仅次于乳糖和脂肪的第三大组分[1]，在成熟乳中含量为5～15 g/L，在初乳中含量为20～25 g/L[2-5]。HMOs 由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸5 个单糖单元组成，其通常包含还原末端的乳糖核心（Galβ1-4Glc），通过几种糖基转移酶的作用与其余3 个单糖单元一起延长，其单糖组成数量一般为3～14 个。根据HMOs 是否被唾液酸化，HMOs 被分类为酸性或中性[6]。虽然HMOs难以被婴儿消化吸收，但是它在婴儿健康成长中仍起着重要作用。大量研究表明，HMOs 与大脑成熟[7-9]，免疫调节[10-11]，肠道菌群调节[12-13]有关，并且这些HMOs 的许多生物学功能与结构有关。例如，3’-唾液酸乳糖（3’-SL）通过选择性肠道细菌定植影响小鼠结肠炎，而其异构体6’-SL 不具有这种生物功能[14]。因HMOs 的一些生理功能，而受到越来越多的关注，有2 种HMO 已在美国与欧洲被正式批准作为新食品成分使用[15]。添加HMO 的婴配粉产品也随之出现。深入了解HMOs 的组成、功能以及生理活性，对于开发更为接近母乳的婴幼儿配方奶粉至关重要。为此，研究HMOs 准确的检测方法至关重要。

母乳组成复杂，含有大量的乳糖与乳脂肪，给HMOs 的分离检测带来较大挑战。HMOs 本身无发色基团，在检测器上的灵敏度低，需进行衍生反应，如发色活性标记物标记，常用的标记物有2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）[16]和2-氨基吖啶酮（AMAC）[17]等。目前，针对母乳低聚糖的分离方法主要有高效阴离子交换色谱（HPAEC）[18-19]、多孔石墨化碳色谱（PGC）[20-22]、毛细管电泳（CE）[23-24]和高效液相色谱（HPLC）[5，25-26]，再辅以安培脉冲（PAD）、紫外（UV）、荧光检测器（FLD）或质谱（MS）来达到将HMOs 分离检测的目的。高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS）相比荧光等检测手段灵敏度更高，分离选择性更好[27]，被广泛应用于HMOs 的定性与定量分析中。本研究基于衍生反应，针对母乳基质建立6 种母乳低聚糖的高效液相色谱-串联质谱的同步定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

母乳样品，伊利提供；氰基硼氢化钠（纯度95%），上海麦克林生化科技有限公司；硼酸（分析纯），上海凌峰化学试剂有限公司；甲酸、甲醇、乙腈、2-氨基苯甲酸、乙酸钠、甲酸铵等均为色谱纯，德国Merck 公司；昆布三糖标准品（纯度≥95%），上海安谱实验科技股份有限公司；2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）、3’-岩藻糖基乳糖（3’-FL）、3’-唾液酸乳糖（3’-SL）、6’-唾液酸乳糖（6’-SL）、乳-N-岩藻五糖-I（LNFP-I）、乳-N-岩藻五糖-V（LNFPV）标准品，纯度均≥90%，英国Carbosynth 公司。

1.2 仪器与设备

Acquity UPLC 超高效液相色谱仪、Xevo TQXS 三重四极杆质谱仪、Masslynx 4.1 数据处理软件，美国Waters 公司；Allegra X-30R 高速离心机，美国Beckman 公司；BSA224S-CW 万分之一天平，德国Sartorius 公司；230V-EU PLUG 涡旋混匀器，美国Labnet 公司；JY88-11N 超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；ST2100通用pH 计，美国OHAUS 公司；Cascada I 超纯水仪，美国PALL 公司；MSC-100 恒温金属浴，杭州奥盛仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 母乳预处理 将母乳样品保存于-80 ℃冰箱，使用前转移到-20 ℃的冰箱放置8～12 h 后，再转移至4 ℃的冰箱放置相同时间，最后再转移至室外放置到室温。解冻后的样品超声10 min（超声功率100%）后，使用超声波细胞破碎机对样品进行均质，均质时间共2 min，工作时间与间隙均为10 s，超声功率为60%。

移取混匀后的母乳样品50 μL 于10 mL 容量瓶中，加入50 μL 昆布三糖标准溶液（125 μg/mL）作为内标，加水定容至刻度后摇匀，移取适量上述稀释液至2 mL 离心管，4 ℃，12 000×g 离心10 min；随后取清液100 μL 加入150 μL 乙腈混匀，相同条件继续离心10 min 后，取上清备用。

1.3.2 衍生剂的选择 分别使用2-氨基苯甲酸（2-AA）、2-氨基苯甲酰胺（2-AB）和2-氨基吖啶酮（AMAC）这3 种衍生剂对HMO 混合标准品进行衍生，比较3 种衍生产物与未衍生HMO 的响应、分离度和峰型，确定最优衍生剂。

2-AA 衍生条件参照Anumula 等[28]的研究，并在此基础上进行调整。取试样100 μL，加入100 μL 2-AA 溶液（30 mg 2-氨基苯甲酸和25 mg 氰基硼氢化钠，溶于1 mL 含4%三水乙酸钠和2%硼酸的甲醇溶液），混匀后于80 ℃金属浴中反应50 min；待反应时间结束后取出放至室温，加入800 μL 70%乙腈水溶液，混匀后装瓶进样。

2-AB 衍生条件参照Austin 等[5]的研究，并在此基础上进行调整。取试样100 μL，加入200 μL标记溶液（0.35 mol/L 的2-氨基苯甲酰胺和1.0 mol/L 氰基硼氢化钠，溶于含30%乙酸的二甲基亚砜中）。将溶液充分混合，并将密闭的试管置于65 ℃的水浴中2 h，然后将试样在4 ℃下冷却10 min，加入700 μL 70%乙腈水溶液，混匀后装瓶进样。

AMAC 衍生条件参照Volpi[17]的研究，并在此基础上进行调整。取试样100 μL，加入50 μL 0.1 mol/L 的AMAC 溶液（溶剂为含15%乙酸的二甲亚砜溶液） 和50 μL 1 mol/L 氰基硼氢化钠，11 000×g 离心3 min 后，45 ℃下反应4 h，冷却至室温，加入800 μL 70%乙腈水溶液，混匀后装瓶进样。

1.3.3 质谱条件优化 电喷雾离子源为正离子模式，毛细管电压3.1 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂温度350 ℃，脱溶剂气流速900 L/Hr，鞘气流速150 L/Hr，进行多反应监测模式（MRM）参数的采集与优化。

1.3.4 色谱条件优化 色谱柱：Waters BEH Amide 柱（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40 ℃；进样量：5 μL；流速：0.4 mL/min。进样室温度：20℃。针对不同浓度的甲酸铵水溶液（流动相A）对衍生后组分响应的影响进行流动相优化，设置4个浓度点，分别为10，25，50，75 mmol/L，pH 值均为4.5，B 相为纯乙腈。相同梯度洗脱，比较不同流动相条件下的响应强度。

1.3.5 方法学验证

1.3.5.1 样品稳定性 取6 份解冻混匀后的母乳样品，前处理后进样检测，在室温下放置24 h 后重复进样检测，通过计算各HMO 的2 次进样结果的相对标准偏差（RSD）来评价前处理后各HMO的稳定性。

1.3.5.2 线性与定量限 将各HMO 标准品配制成2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 质量浓度为100 μg/mL，LNFP-V 质量浓度为10 μg/mL 的混合标准溶液。用纯水稀释混标，得到8 个质量浓度点的标准曲线工作液，其中2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的质量浓度范围为50～10 000 ng/mL，LNFP-V 的质量浓度范围为5～1 000 ng/mL。分别移取100 μL 上述混合标准曲线工作液，各加入10 μL 昆布三糖溶液（2.5 μg/mL），使用最优衍生剂进行衍生后，用70%乙腈水溶液定容至1 mL，混匀后装瓶进样，由液相色谱分离，质谱检测，以浓度为横坐标，峰面积或峰面积与内标浓度的乘积与内标峰面积的比值为纵坐标进行线性拟合，得标准曲线及线性相关系数（R2）。通过对混合标准品的逐步稀释进样，以信噪比S/N=10 为定量限（LOQ）。

1.3.5.3 精密度与回收率 取解冻混匀后的母乳样品，平行6 份，在母乳样品提取之前将已知量的HMOs 混合标准溶液加入母乳样品中，加标量为高、中、低3 个水平，经过同样的前处理步骤完成3 d、3 水平、6 平行加标试验。测定样品浓度，计算测定值的RSD，得到日内精密度和日间精密度。通过从加标样品中测得的量减去未加标样品中测得的每种HMO 的量除以加标量，计算回收率，来评估方法的准确性。以上试验结果均以“平均数±标准差”（±s）表示。

1.4 方法应用

完成上述方法学验证后，应用该方法对来自于10 位志愿者的初乳和成熟乳共20 份母乳样品进行6 种HMO 的定量检测，每份样品重复3 次。

2 结果与分析

2.1 前处理条件

2.1.1 衍生试剂 利用1.3.2 节所述3 种衍生试剂分别对HMO 混合标准品进行衍生后，对其衍生产物与未衍生的HMO 进行比较。6 种HMO 在衍生后响应均有极大的提升，以3’-SL 为例，从图1可知，衍生后与未衍生相比，目标物的响应升高，峰型良好。而2-AA 的衍生产物相较其它2 种衍生，其在色谱柱上的保留更强，前处理也更为简便（反应时间仅50 min），因此本研究选取2-AA 作为HMO 的衍生剂。

图1 标准品衍生物的色谱图Fig.1 Chromatogram of the derivative of the standard

2.1.2 质谱参数 使用标准品进行HMO 及其2-AA 衍生物的母离子和子离子扫描，通过对比不同锥孔电压下的母离子碎片强度和不同碰撞能量下的子离子碎片强度，对锥孔电压和碰撞能量进行优化，得到的参数结果如表1所示。

表1 多反应监测模式（MRM）参数Table 1 Parameters of multiple reaction monitoring mode（MRM）

2.1.3 色谱条件的优化结果 流动相对目标组分响应的影响如图2所示，首先这6 种糖在相同条件下，LNFP-I 和LNFP-V 的质谱响应最低，其余4 种HMO 的响应较高。而LNFP-I+LNFP-V 的响应随着甲酸铵浓度升高，呈现先升高后下降的趋势，在甲酸铵浓度为25 mmol/L 时响应强度最高，因此选取25 mmol/L 甲酸铵为流动相A，并进行洗脱梯度的优化，得到线性梯度洗脱程序：0～0.5 min，90%B；0.5～1 min，90%～80%B；1～2 min，80%～76%B；2～8 min，76%～73.5%B；8～10.5 min，73.5%～70%B；10.5～10.6 min，70%～60%B；10.6～11.6 min，60%B；11.6～11.7 min，60%～90%B，随后保持2.3 min。如图3所示，该方法能够在14 min 内将6 种HMO 很好的分离开。

图2 甲酸铵浓度对HMOs 质谱响应的影响Fig.2 Effect of ammonium formate concentration on the mass spectral response of the HMOs

2.2 方法学验证结果

2.2.1 特异性与样品稳定性 如图3所示，空白对照在各HMO 相应的质谱采集通道不出峰，而母乳样品与混合标准品在相应的质谱采集通道有明显的色谱峰，且响应较强，峰型较好。样品稳定性评价结果如表2所示，可看出经前处理后的样品，经过间隔24 h 的重复进样后，各低聚糖检测结果的相对标准偏差值范围在1.9%～10.3%之间，均小于15%，说明样品具有较好的稳定性，在大批量进样的情况下测定值不会受到较大影响。

图3 空白、标准品以及母乳样品色谱图Fig.3 Chromatograms of blank，standard，and breast milk samples

2.2.2 线性与定量限 由表2可知，2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的线性范围为5～1 000 ng/mL，LNFP-V 的线性范围为0.5～100 ng/mL，所有HMO 的相关系数R2均大于0.99，说明6 种HMOs 在试验设定的浓度范围内线性良好。2’-FL、3’-FL 的定量限为1.5 mg/L，3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的定量限为5.0 mg/L，LNFP-V 的定量限为4.5 mg/L，表明该方法的灵敏度较好。

表2 样品稳定性评价以及方法线性情况Table 2 Evaluation of sample stability and method linearity

2.2.3 方法精密度与回收率 通过连续3 d 的3水平、6 平行试验，通过计算日内精密度、日间精密度以及方法回收率来评价方法的准确性。结果显示，各HMO 的日内精密度范围在1.0%～7.9%之间，日间精密度范围在4.5%～7.4%之间（表3），且回收率为83.2%～119.9%（表4），说明该方法具有良好的准确度与精密度，满足6 种HMO 的准确定量需求。

表3 日内及日间精密度结果Table 3 Results of intra-and inter-day precision

表4 3 水平加标回收试验结果Table 4 Results of three-level spiked recovery test

（续表3）

2.3 母乳检测结果

对母乳样品 进行定量检 测，测定 结果如图4所示，HMOs 含量 的个体差异 较大，2’-FL、3’-FL、3’-SL、6’-SL、LNFP-I 和LNFP-V 质量浓 度范围分别为6.9～3 863.6 mg/L，10.1～2 030.5 mg/L，124.1～451.7 mg/L，317.1～1 225.9 mg/L，6.3～3 624.7 mg/L和4.9～145.8 mg/L，各HMO 测定所得含量基本在前人研究的质量浓度范围之内[5，29-30]，而质量浓度下限要低于文献值，这可能是由于不同方法的检出限与定量限不同所致。

图4 初乳与成熟乳中6 种HMO 的含量情况Fig.4 Contents of 6 HMOs in colostrum and mature milk

3 结论

本研究对2-AA、2-AB 与AMAC 共3 种衍生剂进行比较，选取2-AA 作为最优衍生剂，基于2-AA 衍生化反应，利用超高效液相色谱-串联质谱平台建立了6 种母乳低聚糖的定量检测方法。该方法前处理步骤简单，能够在14 min 内完成6种目标HMO 的分离与定量，各HMO 的线性与稳定性良好，精密度为1.0%～7.9%，回收率为83.2%～119.9%，2’-FL、3’-FL 的定量限为1.5 mg/L，3’-SL、6’-SL、LNFP-I 的定量限为5.0 mg/L，LNFP-V的定量限为4.5 mg/L。方法的精密度与准确度良好，大大缩短了检测时间，可满足母乳中6 种HMO 的准确定量。