磷钨杂多酸的固定化及其酯化黑米花青素的研究

于殿宇，张星震，仲 文，王 宁，王立琦，秦兰霞*

（1东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030 2哈尔滨商业大学计算机与信息工程学院 哈尔滨 150028）

油脂是食品中重要成分之一，而多不饱和脂肪酸容易导致油脂体系在贮存过程中氧化，降低油脂的营养价值，甚至产生有毒物质[1-2]。添加抗氧化物质可有效降低油脂贮藏过程中的氧化，提高油脂体系的稳定性，而合成抗氧化剂，如BHT、TBHQ 等，虽然抗氧化效果明显，但具有一定的毒性及致癌等作用[3-4]。天然抗氧化剂与合成抗氧化物质相比，具有高效性、低毒性、安全性等显著优势，因此用天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂是未来发展趋势。

黑米属于禾本科稻亚族，是具有黑色糙米表皮的稻米，其主要是花青素在表皮中大量累积而导致显示黑色[5-6]。黑米的食用与药用价值都很高，所含的营养成分也相当丰富，其营养成分含量相对其它谷物也较高，除含有种类较齐全的必需氨基酸外，还含有百余种生物活性物质。其中，较为突出的一种活性成分即黑米花青素，具有较强的抗氧化性，可用于预防人类常见的各种老年疾病，如动脉粥样硬化、心脑血管疾病等，还可起到抑菌消炎的作用[7-9]。然而，由于其结构中有多个酚羟基，具有高度的水溶性，在脂类产品中的应用有限，尤其作为油脂类抗氧化剂时，难以在油脂中达到有效的抗氧化效果，在使用过程中须将水溶性花青素改性为脂溶性花青素，可通过化学方法对花青素溶解性进行改善，扩大应用范围[10]。Giusti等[11]通过月桂酸和丙二酸酯化修饰花青素，研究花青素在不同pH 值、光照、温度等条件下的稳定性。Grajeda-Iglesias 等[12]通过亲脂化提高木槿花花青素的脂溶性，并通过高效液相色谱法表征。Khadem 等[13]研究表明，通过酯化修饰不仅可以提高酚类化合物在油脂中的溶解度，还能明显改善生物活性，提高抗氧化性、抗菌性、抗细胞增殖等性能，然而，酯化反应中催化剂分离及残留问题仍未得到有效解决。

SBA 系列主要代表物：SBA-16（三维结构，Im3m）和SBA-15（六方结构，P6mm）。SBA 系列分子筛中最典型的是SBA-15，三嵌段共聚物模板化SBA-15 具有较大孔径和壁厚，以及高度有序的六边形拓扑结构，其内表面吸附多种官能团，使SBA-15 具有较强的吸附能力和稳定性[14-15]。磷钨杂多酸（H3PW12O40）具有强氧化及独特催化特性，在有机酸催化合成、有机氧化-还原等反应中有高选择性和高催化活性的优点，然而存在低比表面积（<10 m2/g），高成本，易流失，污染环境等缺点[16]。因此，采用具有较大比表面积的SBA-15 固定化磷钨杂多酸，制备固定化磷钨杂多酸催化剂，不仅可以有效增加磷钨杂多酸催化剂的比表面积，提高催化活性，还能克服传统酯化反应催化剂难以分离的问题，同时具有收率高，反应条件温和，副反应少，产品纯化简单，可回收再利用以及节约生产成本等优势。

本试验首先采用SBA-15 制备固定化磷钨杂多酸，采用X-射线衍射仪及透射电镜一系列手段来表征该固定化磷钨杂多酸；利用所制备的固定化磷钨杂多酸作催化剂，催化普通黑米花青素的酯化反应，以黑米花青素酯化转化率为指标，在单因素试验的基础上，探讨黑米花青素与乙酸酐比、催化剂添加量、酯化温度、酯化时间条件对酯化转化率的影响，并用红外吸收光谱表征分子结构变化，分析黑米花青素酯化前、后的脂溶性及DPPH自由基的清除能力；最后将脂溶性黑米花青素添加至一级大豆油中，以过氧化值（POV）评价其抗氧化性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑米花青素提取物，陕西天之润生物科技有限公司；SBA-15（孔径，8 nm），南京先丰纳米材料科技有限公司；磷钨杂多酸，上海邦成化工有限公司；DPPH，上海伊卡生物技术有限公司；一级大豆油，九三集团哈尔滨惠康食品有限公司；乙酸乙酯、乙酸酐均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

JY10002 型号电子分析天平，上海精密仪器有限公司；DF-集热式恒温加热磁力搅拌器，上海耀特仪器设备有限公司；马弗炉，苏州诺曼比尔材料科技有限公司；微型旋涡混合仪，上海沪粤明科学仪器有限公司；HH-4J 数显恒温搅拌水浴锅，常州赛普实验仪器厂；BRUKERTENSOR－27 型红外光谱仪，德国布鲁克公司；UV－2450 型紫外/可见分光光度计，日本岛津公司；Siemens D5005 型X-射线衍射仪，德国Bruker 公司；JSM-2010F 型透射电子显微镜，日本JEOL 公司；HWS-280 型数显智能恒温恒湿箱，上海丙林电子科技有限公司；DHP-9082 电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；RE-3000 旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 固定化磷钨杂多酸催化剂的制备 称取SBA-15 分子筛等体积浸渍于磷钨杂多酸H3PW12O40水溶液中，在20 ℃下磁力搅拌，浸渍24 h，浸渍结束后过滤出的分子筛在100 ℃下烘干4 h，再放置于马弗炉中400 ℃焙烧3 h，制得SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂。

1.3.2 X-射线衍射测定 本试验使用的Siemens D5005 型X-射线衍射仪，Cu Kα（λ=0.15418 nm），扫描时管电压50 kV，管电流200 mA，扫描区间2θ=0.6°～6°，扫描速率1°/min，扫描步长0.02°。

1.3.3 透射电镜测定 利用透射电镜，结合XRD图可以确定分子筛材料的晶格和对称性。将测试前的样品仔细研磨，并在乙醇中超声分散15 min，滴在涂碳铜网上，空气中干燥后进行观测，表征样品形貌。

1.3.4 酯化率的测定 参照李成惠[17]的方法，取0.01 g 花青素样品溶解在100 mL pH 值为3.0 的缓冲液中，测定最大吸收波长下的吸光度，使其吸光度在0.2～0.7，计算酯化率。具体计算如公式（1），（2）所示。

式中，A——吸光度值；F——稀释倍数；W——样品质量（g）；C——酯化率；E1——酯化后花青素的色价；M1——酯化后花青素的质量（g）；E——原花青素的色价；M——原花青素质量（g）。

1.3.5 单因素试验设计 评价指标为酯化率，选择反应物配比（黑米花青素与乙酸酐比）、催化剂用量、反应温度、反应时间4 个单因素分别进行单因素试验。固定催化剂用量2.5%，反应温度95.0℃，反应时间4.5 h，探究反应物配比（2∶1，1∶1，1∶2，1∶3，1∶4）对酯化率的影响；固定反应物配比1∶2，反应温度95.0 ℃，反应时间4.5 h，探究催化剂用量（0.5%，1.5%，2.5%，3.5%，4.5%）对酯化率的影响；固定反应物配比1∶2，催化剂用量2.5%，反应时间4.5 h，探究反应温度（75.0，85.0，95.0，105.0，115.0 ℃）对酯化率的影响；固定反应物配比1∶2，催化剂用量2.5%，反应温度95.0 ℃，探究反应时间（2.5，3.5，4.5，5.5，6.5 h）对酯化率的影响。

1.3.6 催化剂回收和重复使用性考察 在上述反应条件结束后，将反应液置于冰箱中2.0 ℃冷藏24 h，大量结晶析出后将其用100 mL 的去离子冷水分别进行洗涂和抽滤，将产物置于80.0 ℃烘箱中干燥，最后计算回收率。

1.3.7 红外光谱分析 参照古明辉等[18]的方法，使用BRUKERTENSOR-27 型红外谱仪，在400～4 000 cm-1范围内，取1～2 mg 样品粉末，然后与KBr 混合均匀并压片，扫描后得到特征谱带。

1.3.8 脂溶性的分析 在250 mL 的烧杯中，加入100 g 大豆油，称取0.010 g（精确到0.001 g）普通黑米花青素和脂溶性黑米花青素，分别逐次加入锥形瓶，将其置入60 ℃的恒温水浴中，搅拌样品至完全溶解，冷却至25 ℃，静置一夜，观察大豆油是否有浑独或沉淀，如果完全溶解，则继续定量添加，重复上述步骤。

1.3.9 DPPH 自由基清除能力测定 参照Arise等[19]的方法并稍作改动，将最优组的脂溶性黑米花青素、普通黑米花青素配制得到适宜浓度的样品，将2 mL 不同浓度梯度稀释的样品与2 mL DPPH 溶液混合，将混合物在黑暗中贮存30 min并测量517 nm 处的吸光度，记作A1；以不加样品时的吸光度值为对照，记作A2；待测样品和DPPH溶液溶剂（乙醇）的混合物的吸光度值为空白，记作A0；平行操作3 次，取平均值，计算如公式（3）所示。

1.3.10 脂溶性黑米花青素长期抗油脂自动氧化特性的测定 将质量分数为0.02%的最优组制备的脂溶性黑米花青素、普通黑米花青素、TBHQ、VE 分别加入纯化后的一级大豆油中，置于60 ℃烘箱内，每7 d 测定1 次POV 值，POV 值按照GB/T 1535-2017[20]进行测定。

1.4 数据统计分析

所有试验一式3 份，结果表示为本研究中的“平均值±标准偏差”。数据采用Origin 8.6 与Design Expert 8.0.6 进行分析和绘制。通过SPSS 22.0 进行ANOVA 单因素方差分析，并采用Ducan检验（P<0.05）检验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 X-射线衍射分析

X-射线衍射用于SBA-15 与SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂的结构表征，SBA-15 固定化前、后的XRD 谱图如图1所示，其中A、B 分别为固定化前的SBA-15 和固定磷钨杂多酸后的SBA-15 的谱图。

图1 XRD 谱图Fig.1 XRD pattern

从图1可以看出，SBA-15 具有4 个明显的特征峰（100）、（110）、（200）和（210），是典型的二维六方状p6mm 结构[21]。固定磷钨杂多酸后的SBA-15 与未经固定化的SBA-15 的XRD 谱图相似，只是衍射峰强度有所降低。这说明磷钨杂多酸填充在分子筛的孔道内，会轻微扰乱介孔孔道内的规整性，然而仍然保持着SBA-15 的六方有序结构。综上所述，磷钨杂多酸已成功固定在SBA-15 上。同时，磷钨杂多酸固定在SBA-15 后，只使孔道内的规整性受到轻微的影响，而孔道结构并没有发生改变。

2.2 透射电镜分析

采用透射电镜观察SBA-15 载体固定化磷钨杂多酸前、后的孔道结构，图2a 为SBA-15 载体的孔道结构，图2b 为固定磷钨杂多酸后SBA-15载体的孔道结构。

由图2a 可知，透射电镜照片展示了SBA-15高度有序的管状孔道结构，是典型的SBA-15 长条形状，其孔径约为7.8 nm，与本文中的材料介绍数据相符。如图2b 所示，经固定磷钨杂多酸后的载体SBA-15 仍然保持着均匀的孔道结构，结构完好，无坍塌。孔道内的结构模糊，说明磷钨杂多酸已被成功引入到孔道内，这表明磷钨杂多酸已经成功固定在SBA-15 上，同时固定后SBA-15 载体的孔道结构不会发生改变。透射电镜表征结果进一步验证了XRD 表征得出的结论。

图2 透射电镜图像（100 000×）Fig.2 Transmission electron microscope images（100 000×）

2.3 SBA-15 固定化磷钨杂多酸酯化黑米花青素单因素试验结果

2.3.1 反应物配比对黑米花青素酯化率的影响 在SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂用量为2.5%，反应温度95.0 ℃，时间4.5 h 条件下，反应物配比对黑米花青素酯化率的影响见图3。

如图3所示，随着乙酸酐含量的增加，添加乙酸酐的黑米花青素酯化率呈现先升高后降低的趋势，反应物配比为1∶2 时，酯化率最高为93.53%，之后随着乙酸酐含量继续升高，酯化率逐渐降低，这可能是因为乙酸酐添加过多时，会有一部分未完全反应，导致酯化不完全，同时造成酯化产物不纯[22]。所以，花青素与乙酸酐最优质量比为1∶2。

图3 反应物配比对黑米花青素酯化率的影响Fig.3 Effect of reactant ratio on esterification rate of black rice anthocyanins

2.3.2 催化剂用量对黑米花青素酯化率的影响 在反应物配比为1∶2、反应温度95.0 ℃、时间4.5 h 条件下，SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂用量对黑米花青素酯化率的影响见图4。

如图4所示，当催化剂添加量小于2.5%时，随着添加量的增加SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化的黑米花青素的酯化率呈升高趋势；当催化剂添加量为2.5%时，酯化率最高为91.80%；当添加量大于2.5%后，随着催化剂添加量的增大，酯化率逐渐降低，对反应的影响不再明显，这可能是因为酯化反应已进行完全，表明催化剂添加过多时，对酯化反应并不起促进作用。在之后过滤催化剂时，造成了催化剂不必要的浪费。所以，催化剂最优用量为2.5%。

图4 催化剂添加量对黑米花青素酯化率的影响Fig.4 Effect of catalyst amount on the esterification rate of black rice anthocyanins

2.3.3 反应温度对黑米花青素酯化率的影响 在反应物配比为1∶2，SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂用量为2.5%，反应时间4.5 h 条件下，反应温度对黑米花青素酯化率的影响见图5。

如图5所示，随着反应温度的升高，SBA-15固定化磷钨杂多酸催化的黑米花青素酯化率呈先升高后降低的趋势，反应温度为95.0 ℃时，酯化率最高为92.60%，随着反应温度持续升高，酯化率下降，这可能是由于温度升高改变了酯化反应的平衡移动方向，从而加快了酯化反应的逆反应[23]。所以，SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化黑米花青素的最佳酯化温度为95.0 ℃。

图5 反应温度对黑米花青素酯化率的影响Fig.5 Effect of reaction temperature on esterification rate of black rice anthocyanins

2.3.4 反应时间对黑米花青素酯化率的影响 在反应物配比为1∶2，SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂用量为2.5%，反应温度95.0 ℃条件下，反应时间对黑米花青素酯化率的影响见图6。

如图6所示，随着反应时间的延长，SBA-15固定化磷钨杂多酸催化的黑米花青素酯化率呈现先升高后降低的趋势，反应时间为4.5 h 时，酯化率最高为93.22%，随反应时间持续延长，酯化反应达到平衡，而酯化率变化较小，这是由于一定的反应时间有利于花青素酯化反应的充分进行，而酯化处理时间太长，酯键受到一定破坏使酯化效果降低。这表明时间的延长无法提高酯化率[24]，还会增加耗能，故反应时间不宜过长。因此，SBA-15固定化磷钨杂多酸催化黑米花青素的最佳酯化时间为4.5 h。

图6 反应时间对黑米花青素酯化率的影响Fig.6 Effect of reaction time on esterification rate of black rice anthocyanins

2.4 催化剂回收和重复使用性分析

SBA-15 固定化磷钨杂多酸在上述最佳反应条件下，对其催化剂的回收和重复使用性进行分析，试验结果如图7所示。

由图7可知，SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂在最佳反应条件后的回收率在90%～80%之间，且经过6 次重复使用后的回收率仍在80%以上，除第2 次使用的回收率有显著下降以外，其余回收率下降不显著，可能是由于实验操作手法以及理论与实践的差异性导致。同时，此结果说明本试验的固定化手段使得催化剂回收率及重复使用性较高，可有效避免催化剂浪费及污染环境等问题。

图7 SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂的重复使用性Fig.7 Reusability of SBA-15 immobilized phosphotungstic heteropoly acid catalyst

2.5 红外光谱分析结果

黑米花青素和脂溶性黑米花青素的基团结构用红外光谱进行分析。红外光扫描图谱如图8所示，其中黑色光谱为普通黑米花青素，红色光谱为脂溶性黑米花青素。

由图8可知，从曲线的变化规律可看出普通黑米花青素与脂溶性黑米花青素的红外分析图具有相似的轮廓。普通黑米花青素的主要吸收峰有3 336.56，2 931.52，1 637.45，1 270.33，1 072.34 cm-1；脂溶性黑米花青素的主要吸收峰有3 338.55，2 931.59，1 697.24，1 639.38，1 552.58，1 272.91，1 074.27 cm-1。根据文献分析[25]，结合峰的位置和形状，-OH 伸缩振动吸收峰在3 336.56（3 338.55）cm-1处；甲氧基C-H 伸缩振动吸收峰在2 931.52（2 935.59）cm-1处；C=O 键伸缩振动吸收峰出现在1 637.45（1 639.38）cm-1处；而羟基上的C-O 伸缩振动吸收峰可能会出现在1 270.33（1 272.91）cm-1处；C-O-C 伸缩振动吸收峰可能会出现在1 072.34（1 074.27）cm-1处。脂溶性黑米花青素在其它官能团的特征吸收峰并没有明显变化，而在1 697.24 cm-1（酯羰基C=O 键的吸收峰）和1 552.58 cm-1（RCOO-的吸收峰）附近出现新的吸收峰，表明酯化处理后的黑米花青素并未破坏花青素的基本结构，酯化反应只是在原来的花青素分子上增加了新的酯基团，关于相似峰与前人的研究报道相似[26]。由于花青素在酯化前、后的组分相当复杂，故只作初步的定性分析。

图8 酯化前、后黑米花青素的红外光谱图Fig.8 Infrared spectrum of black rice anthocyanins before and after esterification

2.6 脂溶性分析

脂溶性反映改性物在油溶性体系中溶解度大小。普通黑米花青素溶于水，而酯化反应后产生的脂溶性黑米花青素不溶于水，而易溶于极性较低的有机溶剂，如甲醇、氯仿和乙酸乙酯。本文分别在25 ℃及60 ℃的恒温水中考察普通黑米花青素及脂溶性黑米花青素在油溶性体系中的溶解度，试验结果如表1、表2所示。

由表1可知，在25 ℃下，普通黑米花青素在大豆油中的溶解量为90～120 mg/100 g，而在60℃下，普通黑米花青素在大豆油中的溶解量为120～150 mg/100 g，超过这个范围就会有沉淀产生。通过表2可看出，普通黑米花青素在酯化反应后溶解性有显著变化，脂溶性黑米花青素是350～400 mg/100 g，超过这个范围大豆油略有浑浊。综上所述，普通黑米花青素被酯化后，在油中更容易溶解，也进一步验证了红外光谱的分析结果，说明酯化后的黑米花青素有新的酯基团产生。国家对各类抗氧化剂在油脂中的添加量有一定限制，其中：BHT 为75 mg/kg，茶多酚为300 g/kg，TBHQ 为120 mg/kg，山梨酸硬脂酸酯为500 mg/kg，VE 为500 mg/kg。由上述试验结果可知，脂溶性黑米花青素在油脂中的溶解度大大高于添加的最高限量，这大大拓宽了花青素在食品工业中的应用，同时也说明脂溶性黑米花青素可以直接应用在植物油及其它人造奶油中。

表1 普通黑米花青素在60 ℃和25 ℃大豆油中的溶解度和透明度Table 1 The solubility and transparency of anthocyanins from black rice in oil at 60 ℃and 25 ℃

表2 脂溶性黑米花青素在60 ℃和25 ℃大豆油中的溶解度和透明度Table 2 The solubility and transparency of oil-soluble anthocyanins from black rice in oil at 60 ℃and 25 ℃

2.7 DPPH 自由基清除率测定结果

物质对自由基清除能力的强弱可以衡量其抗氧化能力的高低[27]，黑米花青素酯化前、后的抗氧化能力如图9所示。

如图9所示，黑米花青素酯化前、后IC50分别为10.0，18.5 μg/mL，清除率随着黑米花青素质量浓度的升高而增大，且酯化后的黑米花青素比普通黑米花青素清除能力降低20%左右，表明经酯化反应后的黑米花青素对DPPH 自由基的清除能力有所下降，这是由于黑米花青素中的酚羟基含量与清除DPPH 自由基能力密切相关，而乙酰酐对黑米花青素的酯化反应发生在酚羟基上，从而使酚羟基数量减少[28]，然而并没有完全消除，因此依旧保留了其较强的清除DPPH 自由基能力，再次表明此方法的酯化过程只对黑米花青素进行了部分修饰，同时SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化酯化反应并没有大幅度改变黑米花青素的整体结构，即保持了黑米花青素的抗氧化性，又增加了脂溶性，同时增大了催化效率，催化剂方便回收，还可反复利用，拓展了天然抗氧化剂的应用范围。

图9 黑米花青素酯化前、后DPPH 自由基的清除率Fig.9 DPPH free radical scavenging rate before and after esterification of black rice anthocyanins

2.8 不同抗氧化剂对一级大豆油长期抗氧化效果的比较

添加不同抗氧化剂的一级大豆油在长期贮存下的过氧化值如表3所示。

表3 不同贮藏时间下各抗氧化剂对一级大豆油过氧化值的影响（mmol/kg）Table 3 Effects of various antioxidants on POV of first grade soybean oil in different storage time（mmol/kg）

如表3所示，所有添加抗氧化剂的油样与空白油样相比，除普通黑米花青素外，其它试验组均有较强的抗油脂氧化能力，且各处理组油样POV随着贮藏时间的延长呈上升趋势。其中，在贮藏21 d 时，脂溶性黑米花青素的油脂POV 值比普通黑米花青素降低了34.78%，且差异显著（P<0.05），说明酯化后的黑米花青素在油脂中的抗氧化性能有所提高，减少不饱和脂肪酸脂质过氧化物的产生[29]，从而延长了油脂氧化的诱导期。这可能是由于在酯化反应中，新增的酯基官能团促使黑米花青素分子更容易分散在油脂体系中，发挥其抗氧化作用[30]。同时，脂溶性黑米花青素的抗油脂氧化活性要大大优于VE，虽然与TBHQ 相比，脂溶性黑米花青素对油脂长期抗氧化效果要略差一些[31]，然而其抗油脂氧化的效果仍非常可观。

3 结论

本试验提供一种制备脂溶性黑米花青素的方法，将制得的SBA-15 固定化磷钨杂多酸催化剂应用于黑米花青素酯化反应。磷钨杂多酸可以固定在SBA-15 分子筛上，同时单因素试验制备脂溶性黑米花青素的条件为反应物配比1∶2，催化剂添加量2.5%，反应温度95.0 ℃，反应时间4.5 h，得到的黑米花青素酯化率可达93.53%，重复使用6 次后，回收率仍在80%以上。通过脂溶性黑米花青素红外光谱分析表明，酯化反应后的花青素在基本未破坏原花青素基本结构的基础上，增加了新的酯基官能团，从而显著提高了黑米花青素在油脂中的溶解性。此外，得到的脂溶性黑米花青素虽然DPPH 清除能力较普通黑米花青素有所降低，但仍具有很理想的抗氧化性，能够有效降低油POV，具有良好的抗油脂氧化能力。