药用真菌中麦角甾醇对偏头痛大鼠的作用机制

刘宇光，王 欢 ，王淑敏 ，刘志新，张 岳

（1.长春中医药大学，吉林长春 130117；2.吉林凯莱英医院化学有限公司，吉林敦化 133700）

偏头痛是一种使大脑神经系统高度衰弱的疾病，其发病机制十分复杂，至今尚不清楚[1]，目前研究认为偏头痛是一种血管-神经-递质调节障碍性神经内科疾病，发病机制以三叉神经血管反射学说为主流[2]。当三叉神经末梢受到内、外刺激兴奋后，随之释放降钙素基因相关肽等血管活性物质，舒张血管，使血浆外渗、肥大细胞脱颗粒，神经源性炎症产生。同时三叉神经末梢伤害性感受器将痛觉冲动通过神经纤维传入脑内，引起头痛[3−4]。在现阶段临床研究中发现，偏头痛患者发病先兆期，血小板会释放血管收缩胺5-HT引起外周5-HT升高，导致血管痉挛收缩，但随着单胺类神经递质5-HT被代谢成5-HIAA后，血管反跳性扩张，引起血管壁伤害痛觉神经纤维兴奋，导致偏头痛发作[5−6]。5-HT 等血管活性物质的变化及NE、DA 等神经递质异常变化，也会促进偏头痛的发生。

麦角甾醇是真菌细胞膜及线粒体膜上的重要组成成分，影响细胞膜的通透性、膜的完整性及细胞的活力[7]，另外，麦角甾醇参与细胞膜上功能结构域的形成，调控细胞周期、物质运输、细胞间信息交流、菌丝生长发育等多个生物学过程[8]。麦角甾醇具有真菌特异性，广泛存在于药用真菌冬虫夏草、桦褐孔菌、灵芝、香菇等食药用真菌中，是食药用菌中存在的一种重要的活性物质[9−12]，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、降低胆固醇等多种生物活性[13−14],其对偏头痛的药理作用，尚未见报道。

因此，本研究从药用真菌马勃中分离纯化得到麦角甾醇，利用硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型，考察麦角甾醇的镇痛抗炎作用，并探索其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

动物 健康合格级雄性SD大鼠50只（160～200 g），由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号SCXK（辽）2015-0001，合格证编号：211002300019705，长春中医药大学动物中心饲养，遵守伦理审查，由动物实验中心进行无害化处理；硝酸甘油注射液 北京益民药业有限公司，5 mg/mL，国药准字H11020289；苯甲酸利扎曲普坦片 湖北欧力制药有限公司，5 mg/片，国药准字H20080740，用前以蒸馏水配置成混悬液；麦角甾醇 马勃提取物的石油醚层，经反复硅胶柱层析及制备液相色谱（石油醚-乙酸乙酯，9:1）制备得到，经HPLC定量分析，其纯度为98%；NO试剂盒 南京建成生物工程研究所，批号20170424；白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、5-HT、去甲肾上腺素（NE）、多巴胺（DA）检测试剂盒 南京建成生物工程研究所，批号20170505；RIPA 裂解液、BCA蛋白定量试剂盒 北京索莱宝科技有限公司；抗体P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3、P-NF-κB p65、NF-κB p65 英国Abcam公司。

Rayto RT-6000酶标仪 上海天呈医流科技股份有限公司；UV-2450双光束紫外可见分光光度计、AUY220精密电子天平 岛津制作所；F6/10手持式匀浆机 上海净信科技；TGL16M 台式高速冷冻离心机 湖南凯达科学仪器有限公司；凝胶成像系统美国BIO-RAD 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与给药 将健康合格大鼠在温度：（23±1）℃，相对湿度：55%±5%，12 h光暗循环条件下自由摄食、饮水，实验严格按照实验动物伦理学规则进行，经长春中医药大学动物伦理委员会批准。适应性饲养1周后，按体重随机等分成5组：空白对照（生理盐水1 mL/100 g）组，模型（生理盐水1 mL/100 g）组，阳性药（苯甲酸利扎曲普坦1 mg/kg）组，麦角甾醇低剂量（15 mg/kg）组，麦角甾醇高剂量（30 mg/kg）组，每组10只，每只编号并记录体重。每日于大致相同时间按体重分别给每鼠灌胃相应的药物，受试组灌胃给药1 次/d，连续灌胃7 d[15−17]。

1.2.2 造模 末次给药前禁食16 h，自由饮水。于最后一次给药30 min后，除空白组外，将其余各组大鼠按给药顺序分别皮下注射硝酸甘油，给药剂量10 mg/kg，造模30 min后，大鼠出现甩头、前肢挠头、躁动不安、双耳发红、蜷卧活动减少等现象，证明造模成功[18−20]。

1.2.3 样本采集与处理 造模4 h后，按造模前后顺序麻醉大鼠（腹腔注射水合氯醛0.3 g/kg），将其固定于解剖台上，分别自腹主动脉取血样，收集血液后，4 ℃离心（3000 r/min，10 min）；大鼠取全脑，冰上分离下丘脑，剥离附着的组织，直接称重（天平精密度为0.1 mg），加入PBS匀浆，制成1:9的供试液，4 ℃离心（3000 r/ min，10 min），取上清分装小管，−20 ℃保存。

1.2.4 生化指标检测 ELISA法检测血清中NO、IL-1β、IL-6的水平及下丘脑组织中NE、DA、5-HT的含量。

1.2.5 Western blot 检测下丘脑组织中JAK2、STAT3、NF-κB p65蛋白含量的表达 收集下丘脑组织，提取总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度。上样，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并转移到PVDF膜上，室温条件下封闭1 h。一抗在4 ℃条件下孵育过夜，然后与二抗在室温条件下用TBST溶液冲洗PVDF膜3次，然后以同样的方法敷育二抗，孵育时间为1 h。化学发光法（ECL）发光试剂显影，图像分析软件扫描，分析。

1.3 数据处理

采用GraphPad Prism 5软件对数据进行统计学处理，数据结果用x¯±s表示，组间评估使用单因素方差分析（ANOVA）的Tukey多重比较检验进行分析。P＜0.05表明具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 对偏头痛大鼠行为等影响

正常组大鼠饮食正常，状态良好，活动灵敏；造模30 min后，模型组大鼠出现甩头、前肢挠头、躁动不安、双耳发红、蜷卧活动减少等现象，经预防性给药后，模型大鼠的上述现场明显减少或改善。

2.2 麦角甾醇对实验性偏头痛大鼠血清中NO、IL-1β、IL-6水平的影响

研究考察麦角甾醇对偏头痛大鼠血清中NO水平的影响，与空白组比较，模型组大鼠血清中NO水平极显著升高（P＜0.001）。与模型组比较，阳性药组和麦角甾醇给药组的NO的水平均显著降低（P＜0.01；P＜0.05），结果见下表1。NO可以使血管扩张，同时也可以通过激活三叉神经末梢释放 CGRP 诱发神经源性炎症反应引起偏头痛。因此，麦角甾醇可以有效减缓血管扩张或神经源性炎症引起的偏头痛。

表1 麦角甾醇对偏头痛大鼠血清中NO水平的影响（x¯±s，n=10）Table 1 The effect of ergosterol on the NO level in serum of the migraine rats (x¯±s, n=10)

由表2可知，与空白对照组比较，模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6水平显著升高（P＜0.05，P＜0.001），具有统计学差异。与模型组比较，阳性药组大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平降低（P＜0.05），麦角甾醇低剂量组大鼠血清中IL-1β、IL-6的水平显著降低（P＜0.001，P＜0.05），麦角甾醇高剂量可以极显著降低大鼠血清中IL-1β、IL-6水平（P＜0.001）。研究表明，麦角甾醇给药组可显著降低偏头痛大鼠血清中上述炎症因子的水平，减轻神经源性炎症反应。

表2 麦角甾醇对偏头痛大鼠血清中IL-1β、IL-6水平的影响（x¯±s，n=10）Table 2 The effect of ergosterol on the IL-1β and IL-6 levels in serum of the migraine rats (x¯±s, n=10)

2.3 麦角甾醇对实验性偏头痛大鼠下丘脑中5-HT、NE、DA水平的影响

由表3可知，与空白对照组比较，模型组大鼠下丘脑中5-HT水平极显著降低（P＜0.001）。与模型组比较，阳性药组大鼠下丘脑中5-HT水平极显著升高（P＜0.001），麦角甾醇低剂量组大鼠下丘脑中5-HT水平显著升高（P＜0.05）。5-HT 是一种与偏头痛的发生紧密相关的神经递质，偏头痛发作前，血浆中5-HT迅速升高，偏头痛发作时，血液中 5-HT 被迅速代谢为 5-HIAA，大量减少[21]，因此麦角甾醇可提高偏头痛大鼠发作时血浆中5-HT的水平。

表3 麦角甾醇对偏头痛大鼠下丘脑中5-HT水平的影响（x¯±s，n=10）Table 3 The effect of ergosterol on the 5-HT level in brain tissue of the migraine rats (x¯±s, n=10)

由表4可知，与空白对照组比较，模型组大鼠下丘脑中NE、DA水平显著降低（P＜0.05，P＜0.001）。与模型组比较，阳性药组大鼠下丘脑中NE和DA水平显著升高（P＜0.05），麦角甾醇低剂量组大鼠下丘脑中NE、DA水平显著升高（P＜0.001，P＜0.05），麦角甾醇高剂量可以显著升高造模后大鼠下丘脑中NE、DA水平（P＜0.001，P＜0.05）。脑内神经递质NE、DA的代谢紊乱会促进偏头痛的发生和发展[22]，结果表明麦角甾醇可有效调节下丘脑中NE和DA的水平。

表4 麦角甾醇对偏头痛大鼠下丘脑中NE、DA水平的影响（x¯±s，n=10）Table 4 The effect of ergosterol on NE and DA levels in brain tissue of the migraine rats (x¯±s, n=10)

2.4 麦角甾醇对实验性偏头痛大鼠下丘脑中PJAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65蛋白表达的影响

如图1所示，与空白组相比，模型组P-JAK2、PSTAT3、P-NF-κB p65蛋白含量显著升高（P＜0.001）。与模型组比，阳性药和麦角甾醇各给药组均可显著抑制下丘脑组织中P-JAK2、P-STAT3、P-NF-κB p65蛋白表达水平（P＜0.001）。JAK2/STAT3 信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的途径，同时，JAK2/STAT3 通路的激活也促进炎症的产生[23]。本研究结果表明，麦角甾醇可能通过抑制 JAK2/STAT3/NF-κB信号通路，减少IL-1β、IL-6等炎症因子，减轻由炎症所致的头痛。

图1 麦角甾醇对下丘脑组织中P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65蛋白表达的影响Fig.1 The effect of ergosterol on P-JAK2、T-JAK2、P-STAT3、T-STAT3、P-NF-κB p65、T-NF-κB p65 expression in brain tissue of the migraine rats

3 结论

本次实验中采用硝酸甘油诱导的偏头痛大鼠模型，其行为表现与发病机制同临床患者偏头痛发作时的症状表现和病理变化具备一定程度的相似性，可以很好地仿效偏头痛发作的病理生理过程。当硝酸甘油吸收入血后，经代谢、分解释放NO，而NO兼有内源性扩张因子和神经递质的双重作用，所以通过扩张颅内血管、激发神经源性炎症反应以及兴奋伤害觉神经纤维从而诱发偏头痛[24]。

本试验结果表明，实验组大鼠经硝酸甘油诱导后，血清NO水平和炎症因子IL-1β、IL-6水平均升高，证明大鼠偏头痛模型建立成功。说明硝酸甘油既可以刺激机体产生大量的NO、IL-1β、IL-6，引起炎症反应，进而引发头痛，又说明硝酸甘油能够直接刺激大脑皮层及血管扩张，使头痛产生。而造模后的偏头痛大鼠经不同剂量麦角甾醇治疗后，与模型组比较，血清5-HT水平升高（P＜0.05），血清NO水平（P＜0.05）、炎症因子IL-1β、IL-6水平降低（P＜0.05；P＜0.001），同时下丘脑中DA和NE水平也明显升高（P＜0.001；P＜0.05），并且麦角甾醇促进了p-JAK2、p-STAT3和P- NF-κBp65的表达，这说明麦角甾醇不仅能调节血管活性物质、神经递质代谢平衡，降低炎症因子水平，还可以减弱疼痛信号传递。

NF-κB是一种多亚基转录因子，可调节多种与炎症相关的靶基因[25−26]。同时STAT蛋白也是炎症反应的关键转录因子，STAT信号通路通常被JAKs激活，调控着细胞因子的基因表达。研究结果表明麦角甾醇可以抑制NF-κBp65易位至其诱导的细胞核激活各种炎症相关基因，减弱JAK/STAT信号通路的激活，减轻由炎症所致的头痛。

综上所述真菌来源的麦角甾醇可能通过改善颅内外血管舒缩功能，减轻神经源性炎症反应，抑制伤害痛觉中枢传递来发挥治疗偏头痛的作用，其作用机制可能是抑制下丘脑中NF-κB和JAK2/STAT3 信号通路，减轻炎症及疼痛反应，从而达到缓解或治疗偏头痛的目的。