三七总皂苷对雄激素性脱发小鼠的改善作用及机制研究

胡 俊 张敬芳 候圣祥 姚依韬 冯振国 李小溪 潘梦佳 魏 强 陈天禹

长沙医学院临床学院，湖南长沙，410219

雄激素性脱发(androgenetic alopecia，AGA)又称为脂溢性脱发，通常在20～35岁的男性中发病率较高。据统计，全世界范围内25岁前发病的男性患者在整个男性人群中的占比为60%，而30岁前发病的男性患者在整个男性人群中的占比为83.9%[1]，而60岁女性秃头的发病率达50%[2]。近年来，患有AGA的人数越来越多，而且发病人群的年龄越来越小，对患者的日常生活和思想情绪等方面产生了较为严重的影响[3]。目前认为遗传、雄激素途径、细胞因子等是其主要的诱因，但发病机制尚不清楚[4]。与头皮其他部位的健康毛囊产生的较为结实的终毛相比，受AGA影响的毛囊会通过更小的基质转运放大细胞隔室而发生微型化改变，从而产生更细、色素更少的毳毛，并且逐渐发展成为永久性的，不可逆的毛囊丢失[5]。

三七总皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是从三七草药加工提取得到的一种化学成分，包含了多种不同单体，例如：Rg1、Re和三七皂苷R1等[6]，具有改善心肌缺血[7]、消肿止痛、抗氧化应激、促进机体血液供应[8]、抗抑郁、抗焦虑等多种功效[9]。药理研究表明，在PNS的作用下VEGF及其特异性受体的表达得到上调，并能有效促进血管产生[10]。有学者发现，VEGF的表达通常在人毛囊真皮乳头细胞和真皮鞘细胞中发生，能够促进毛发的生长和变粗，而对于患有AGA的患者而言，局部头皮内VEGF的水平明显低于正常，甚至消失[11]。提示PNS可能通过促进VEGF表达从而对AGA起到一定的改善作用。真皮乳头细胞分泌的TGF-β1，对毛发循环的退行期扮演着重要角色，可引起毛囊基质细胞凋亡，继而引发毛囊微型化和脱发的发生，源自AGA病变部位毛乳头细胞的雄激素诱导型TGF-β1是AGA中雄激素诱导的毛发生长抑制的原因[12]，当TGF-β1表达水平较高时，毛发生长将会受到影响，进而引发脱发，这是雄激素性脱发出现的一个非常重要的因素[13]。到目前为止暂未发现三七总皂苷对雄激素性脱发改善作用的研究。本课题组通过建立AGA小鼠模型，观察三七总皂苷改善C57BL/6小鼠雄激素性脱发模型效果，探究其对AGA小鼠模型脱发区毛囊、终毛、毳毛的数目、终毛/毳毛的比值、组织中VEGF、TGF-β1表达以及血清激素、VEGF含量的影响，对其作用机制进行研究。

1 资料与方法

1.1 实验动物 试验选取40只雄性小鼠为研究对象，这些小鼠的体重数值控制在25～27 g的范围内、而生长周期基本都在10周龄左右。将小鼠放到长沙医学院动物实验中心进行为期2周的适应性喂养，环境温度为24℃，湿度数值为53%，人工饲料饲喂，不限食水。

1.2 主要药品与试剂 丙酸睾酮注射液：杭州动物药品厂，规格：25 mg/mL，批号：190711。非那雄胺：杭州默沙东制药公司，批号：J01305A。三七总皂苷：湖南湘雅制药公司，批号：1905117。睾酮ELISA试剂盒：湖南欧赛德生物科技公司，批号：011A20。VEGF(批号：2155151180220)、TGF-β1(批号：229151231220)试剂盒：武汉博士德生物公司。

1.3 主要仪器 高清显微镜:日本奥林巴斯公司，恒温箱：上海精宏公司，PW-812洗板机：深圳市汇松公司，SH01D离心机：上海知信实验仪器公司，XH-C漩涡混合器：江苏大唐公司，移液枪、Multiskan FC酶标仪：Thermo公司。

1.4 小鼠雄激素性脱发模型建立及分组给药 将试验小鼠均等分成4组，分别是空白组、模型组、阳性组和三七皂苷组。空白组之外的3组小鼠，将5 mg/(kg·d)丙酸睾酮稀释溶液平行于脊柱背部皮下注射，空白组实施同等剂量的注射油。同时实施对应的用药，阳性药物组给予非那雄胺片0.65 mg/(kg·d)，三七总皂苷组的用药标准为100 mg/(kg·d)，空白组和模型组选择等体积的蒸馏水，试验持续60天。

1.5 观察指标及测定

1.5.1 小鼠一般状态及背部毛发生长情况观察 观察每个时间段各组小鼠的一般状态包括体重、活动度等，拍照记录小鼠肉眼观毛发脱落情况。

1.5.2 毛囊组织病理学观察 实验第60天取小鼠脱毛区域皮肤组织约2 cm×2 cm，用硬质塑料板固定，防止卷曲收缩，4%多聚甲醛固定，进行切片制作。在100倍高清显微镜进行图像数据采集，包含毛囊、终毛和毳毛的生长数量。毳毛毛干短，稀薄，细小，通常没有发髓且没有立毛肌，延伸的深度不超过上层真皮，产生的轴不超过其内根鞘。与毳毛相比终毛毛干更粗，更长，色素深[14]。每个切片选取三个没有重叠的视野，取其平均值进行统计分析。

1.5.3 小鼠血清VEGF、睾酮含量的测定 持续用药60天后，从试验小鼠的眼球部位采血，将采集到的血液放到高速离心机中按照转动速度3000 r/min进行10 min的离心操作，将血液中的血清完全分离出来，之后使用试剂盒完成血清中睾酮和VEGF的浓度数据检测。

1.5.4 皮肤组织VEGF、TGF-β含量测定 给药60天后，选取小鼠脱毛部位的皮肤，将剩余的毛发处理干净，将其制成浓度为10%的组织匀浆，使用试剂盒完成其中VEGF、TGF-β1的浓度检测。

1.6 统计学方法 Excel录入数据，使用Graphpad 9.0处理分析，用单因素方差分析检验显著性，P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态及脱发情况的观察结果 实验过程中所有的小鼠正常摄入食物和水分，除空白组外，其余各组体重在正常范围内稍有下降。在小鼠背部皮下注射丙酸睾酮后，出现明显的厮打现象。实验第25天左右毛发失去原有的光泽，35天左右毛发逐渐脱落。用药60天后，继续观察小鼠背部脱毛区，未见表皮的局限性浅表缺损、水肿等异常表现(图1)。模型组小鼠背部毛发脱落减少，毛发稀疏，背部脱发区域广呈灰白色；空白组毛发有光泽、覆盖完全；阳性组脱发区域毛发覆盖较完全，基本呈黑色接近于空白组；三七总皂苷组较模型组脱发区缩小域呈灰黑色，可见大量新生毛发，其作用趋势开始逐步接近阳性组。

2.2 三七总皂苷对小鼠背部毛囊数量及终毛/毳毛比值的影响 病理切片、毛囊计数结果表明，空白组毛囊分布均匀，可见大量毛干粗毛干色素深的终毛；模型组毛囊少分布稀疏，且多为毛干细毛干色素浅的毳毛；阳性组毛囊数目多接近正常组；三七总皂苷组毛囊较模型组毛囊数目增多，且多为毛干粗毛干色素深的终毛。相比空白组的小鼠，模型组皮肤总毛囊、终毛数量都有了很大程度的降低(P<0.01)，终毛/毳毛占比数值大幅度减小(P<0.01)，这表明试验的模型是成立的。相比模型组而言，阳性组小鼠皮肤毛囊数目、终毛毛囊数目以及终毛/毳毛比值显著增加(P<0.01)；三七总皂苷组小鼠皮肤毛囊数目、终毛毛囊数目明显增加(P<0.01)，终毛/毳毛比值也有所增加(P<0.05)，说明这两种药物能增加小鼠毛囊的数量，来达到改善小鼠雄激素性脱发的效果。三七总皂苷组毛囊数目较阳性组有一定差距，但是有逐渐接近的趋势(图2、3)。

2.3 三七总皂苷对小鼠血清睾酮，VEGF含量的影响 相比空白组而言，模型组睾酮在血清中的浓度数值显著提升(P<0.01)，血清VEGF含量明显下降(P<0.01)，提示造模成功。相比模型组而言，阳性组血清睾酮的浓度数值明显减小(P<0.01)，血清VEGF的浓度数值并没有出现较大幅度的增大(P>0.05)。三七总皂苷组小鼠血清睾酮含量较模型组无明显变化(P>0.05)，高于阳性组。三七总皂苷组血清VEGF含量较模型组、阳性组明显升高(P<0.01)，与空白组无统计学差异(图4)。

1a：空白组小鼠毛发密集有光泽；1b：模型组小鼠毛发脱落，融合成片；1c：阳性组毛发覆盖较完全；1d：三七总皂苷组较模型组小鼠毛发密集可见大量新生绒毛

2a：空白组毛囊数目多分布密集；2b：模型组毛囊数目明显减少稀疏；2c、2d：阳性组、三七总皂苷组较模型组毛囊数目显著增多且分布更加广泛，可见较多的毛干色深直径大的生长期毛囊(HE，×100)

图3 3a～3d:三七总皂苷对小鼠总毛囊数目、终毛毛囊数目、毳毛毛囊数目、终毛/毳毛毛囊数目的影响*P<0.05,***P<0.001

图4 4a、4b:三七总皂苷对小鼠血清睾酮、VEGF表达影响*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001 图5 5a、5b:三七总皂苷对小鼠皮肤组织中VEGF、TGF-β1表达影响*P<0.05,***P<0.001

2.4 三七总皂苷对小鼠皮肤组织中VEGF、TGF-β含量的影响 相比空白组而言，模型组皮肤组织含有的VEGF浓度数值明显减少(P<0.01)，TGF-β1浓度数值明显增大(P<0.01)；相比模型组而言，三七总皂苷组和阳性组对应的VEGF浓度数值明显增大(P<0.01)，其中三七总皂苷组皮肤组织中VEGF表达量上升的幅度较阳性组更加显著(P<0.01)。与模型组相比三七总皂苷组和阳性组皮肤组织中TGF-β1的表达量下降(P<0.01，P<0.05)，三七总皂苷与阳性组基本接近(图5)。

3 讨论

AGA也称为男性型脱发，是一种常见的慢性皮肤疾病。通过5a-还原酶II型将睾酮转化为二氢睾酮，以及在遗传易感性毛囊的真皮乳头内存在雄激素受体来介导[15]。最新研究显示因严重新冠肺炎感染而住院的男性，与相同人群的预期相比，雄激素性脱发的发生率非常高[16]，可能与雄激素受体信号传导可导致跨膜丝氨酸蛋白酶2的表达与关[17]，但其发病机制尚不明确。

AGA与各种生长因子的调节，以及局部血液循环等有关。在毛发周期的生长期毛囊周围血管形成显著增加，毛囊外围的血管量增多与其外根鞘角质形成细胞VEGF表达水平增强有着较为密切的关联。VEGF在毛囊外根鞘角质形成细胞内的表达水平过高，能够提升毛发的生长速度以及毛囊和毛干的相关数值[18]。“发为血之余”，解决脱发的有效手段通常有两种，一种是保证毛囊获取更多的养分，另一种就是使其微循环环境更加理想，真皮乳头细胞释放出的VEGF能够促进机体形成更多的毛细血管，保证血管量增多[19]，对毛囊起到营养作用[20]。而当微循环灌注的紊乱导致血液循环中血液灌注速度和流量的降低，从而影响到头皮毛囊的正常氧气供应，导致脱发[21]。经过睾酮转化而来的二氢睾酮诱导毛乳头细胞TGF-β1抑制毛囊上皮细胞生长[22]。当TGF-β1的表达下调时可通过维持毛囊的退行期和毛囊细胞的活力来防止脱发[23]。

目前国内治疗男性雄激素性脱发的主要药物有非那雄胺口服和米诺地尔溶液外用，有些患者因为其产生的不良反应拒绝治疗[24]。而部分中药治疗脱发类疾病有确切疗效，三七总皂苷能够有效促进血流供应，有较强改善微循环的作用[8]，且口服不良反应发生率极低，主要集中在过敏反应、消化道反应，一般症状较轻，停药后多数症状消失[25]，价格实惠等优点。因此该研究选择中药单体三七总皂苷作为研究对象，通过实验研究进一步了解其临床疗效和作用机制。

本实验选取C57BL/6小鼠为实验对象，采用背部皮下注射丙酸睾酮溶液建立AGA鼠类模型，基本和AGA的病理现象是一致的。观察记录小鼠在用药后毛发的生长状况、各种状态下的毛囊计数、血清中睾酮VEGF含量及皮肤组织中VEGF、TGF-β1表达量。

在实验过程中，将C57BL/6小鼠背部皮下多点注射6周丙酸睾酮后，有明显的毛发脱落现象，模型组小鼠体内激素水平失衡、肉眼可见的毛发减少以及皮肤病理切片显示的毛囊数目明显减少，说明AGA小鼠模型建立成功。模型组小鼠皮肤中TGF-β1表达量明显升高，这与胡嘉元等[26]在实验中的结果有所不同，分析原因可能与实验小鼠品种等因素有关。除空白组外各组均出现了不同程度的好斗、易激惹，这可能与造模时背部皮下注射丙酸睾酮引起小鼠体内雄激素增高有关。研究结果显示在用药60 d后，三七总皂苷组小鼠与模型组相比，外观上毛发更有光泽，脱发面积有所减小，脱发区域的皮肤颜色加深，组织病理学切片显示皮肤毛囊数目、终毛毛囊数量显著增多(P<0.01)，终毛/毳毛的占比数值也相对增大(P<0.05)，说明三七总皂苷可以改善AGA模型小鼠的微型化。三七总皂苷组相比模型组和阳性组，血清含有的VEGF浓度数值明显增大(P<0.01)，而且皮肤组织含有的VEGF浓度数值增大(P<0.01)，可能与给予三七总皂苷后对小鼠局部组织微循环改善以及全身血液循环的促进有关。而TGF-β1含量降低(P<0.05)，所以三七皂苷对小鼠脱发起到一定的预防和改善作用。除阳性组外，其他使用药物的小鼠血清含有的睾酮浓度数值和模型组的数值较为接近，在统计学上的差异较小，说明三七总皂苷对AGA小鼠血清睾酮浓度无明显影响，而使用非那雄胺药物的小鼠血清含有的睾酮浓度数值明显要比模型组更低(P<0.01)，这和其作用机理是相同的。虽然从本实验结果上看三七总皂苷的疗效与阳性药物组有一定差距，但是三七总皂苷组小鼠血清中VEGF含量和小鼠皮肤组织中VEGF的表达量明显高于阳性组，因此说明三七总皂苷较非那雄胺有较强的微循环改善作用，从而对AGA起到一定的改善，加上三七总皂苷能有效降低皮肤组织中TGF-β1的表达对AGA小鼠脱发其有一定的预防作用，而且其不良反应少，发生率低，因此说明三七总皂苷可作为一种预防和改善AGA发生的药物。我们期待三七总皂苷能否与非那雄胺等一线用药联合用药来进一步提高AGA治疗效果，则需要进一步设计实验研究。

综上所述，我们发现三七总皂苷对C57BL/6雄激素性脱发模型小鼠脱发有一定预防和改善作用，且在实验过程中未发现明显的毒副作用。其作用机制可能与上调小鼠皮肤组织和血液中VEGF的表达，下调小鼠皮肤组织中TGF-β1表达相关。