青海高原长期复种绿肥毛叶苕子对土壤氨氧化细菌和氨氧化古菌的影响

韩 梅，高嵩娟，李正鹏，严清彪，曹卫东

(1.青海大学农林科学院土壤肥料研究所,青海 西宁 810016；2.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081;3.南京农业大学，江苏 南京 210095)

绿肥在我国有着悠久的发展历史，是传统农业的精华，可以改善土壤有机质，减少化肥的施用，增加土壤微生物的丰度和活性，对生态保护、可持续发展、粮食安全等具有重要意义。土壤微生物在土壤氮素转化中占主导地位[1]。大量研究表明，种植翻压绿肥可以增加土壤微生物的数量和多样性，改变土壤微生物的组分和结构[2-3]。微生物驱动的氮循环主要包括硝化、反硝化、固氮和氨化[4]，其中硝化作用包括硝化和亚硝化作用两个过程。在硝化微生物的作用下，有机物氨化后产生的铵态氮转化为硝态氮。反硝化是一个微生物氧化还原过程，硝酸盐和亚硝酸盐逐渐转化为气态最终产物(NO, N2O和N2)[5]。农田的氮循环过程涉及硝化作用[6]，氨氧化是硝化作用的第一步[7]。土壤氨氧化是土壤氮素循环的关键环节，是由各种氨氧化微生物驱动完成。其中，氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的数量、种群结构及多样性是衡量土壤肥力和健康状况的生物学指标[8]。施肥引起的土壤中AOA和AOB的变化引起了科学家的广泛关注。AOA和AOBamoA基因的丰度经常被用来评价不同土壤参数和管理方法对氨氧化微生物群落大小的影响。大量研究表明，氨氧化过程是由土壤AOA和AOB共同进行的，不同施肥类型和施肥量对土壤AOB和AOA的影响不同。在自然生态系统中，AOA比AOB更为丰富[9-10]。

青海省地处高原冷凉地区，麦后复种绿肥对青海高原地区绿肥-小麦生产系统土壤AOB和AOA数量和群落组成的影响仍不清楚，亟待研究。系统研究复种绿肥，翻压、留茬条件下土壤微生物的变化将有助于了解不同施肥模式下土壤培肥机制，掌握土壤氮素循环和转化情况，对青海高原地区复种绿肥、减施化肥对土壤肥力的影响及生产绿肥有机农产品具有指导性意义。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

试验地位于青海省西宁市城北区农科院试验地，海拔为2 282 m，纬度101.75°，经度36.72°。气候冷凉，属高原大陆性半干旱气候。年平均气温5.9℃，作物生长期为220.2 d。全年平均气温日较差为13.5℃，年平均降水量367.5 mm，年均蒸发量为1 729.8 mm。试验区主要水源为北川渠，灌溉条件较好。土壤类型为栗钙土，前茬作物为油菜。

1.2 供试材料

供试绿肥为毛叶苕子，养分含量C 46.32%、N 2.45%、P 0.31%、K 1.82%；毛苕子根茬养分含量N 2.43%、P 0.78%、K 0.98%。供试小麦品种为青春38；供试肥料为尿素(含N46%)、过磷酸钙(含P2O512%)。供试土壤为栗钙土，土壤pH值为8.31，有机质16.67 g·kg-1，全氮1.11 g·kg-1、全磷2.18 g·kg-1、全钾26.33 g·kg-1、碱解氮98 mg·kg-1、有效磷13.1 mg·kg-1、速效钾139 mg·kg-1。

1.3 试验设计

试验地位于青海省西宁市城北区农科院试验地，是2010年布置的一个绿肥长期定位试验。该试验采用青海省绿肥作物适种区主栽作物小麦、油菜轮作模式，2017年度以小麦为主作，试验采用随机区组设计。试验共设9个处理:100%化肥+绿肥根茬(F100+GR)；90%化肥+绿肥根茬(F90+GR)；80%化肥+绿肥根茬(F80+GR)；70%化肥+绿肥根茬(F70+GR)；60%化肥+绿肥根茬(F60+GR)；不施肥+绿肥根茬(F0+GR)；70%化肥+绿肥翻压(F70+GT)；不施肥(F0)；100%化肥(F100)。其中100%化肥为N 225.0 kg·hm-2、P2O5112.5 kg·hm-2。 4次重复，小区面积20.0 m2(5.0 m×4.0 m)。

于2017年3月15日播种小麦，播量300 kg·hm-2，播种前将肥料均匀撒施，深翻。在7月下旬小麦收获后复种毛叶苕子，播量105.0 kg·hm-2，播种后灌水，10月中旬收获，需压青处理，将该区收获的毛叶苕子铡切成10 cm左右后进行翻压，毛叶苕子鲜草翻压量为30 000 kg·hm-2。

1.4 样品采集

在小麦播种期(3月15日)、抽穗期(6月8日)、成熟期(7月25日)采集5～20 cm土层土壤样品。在小区内随机选择3个样点，均匀混合后保存于-80℃冰箱。

1.5 测定项目及方法

1.5.1 DNA 提取与标准品、标准曲线的制备 土壤DNA采用PowerSoil DNA提取试剂盒提取。每个样品提取3个重复，每个重复由3份DNA混合而成。DNA质量由NanoDrop ND-1000分光光度计测定260 nm/280 nm和260 nm/230 nm比值确定。

普通PCR扩增仪进行PCR扩增。反应体系为25μl，包括模板DNA0.5 μl，引物F(10μM)0.5 μl，引物 R (10 μM) 0.5 μl，dNTP (10 mM) 2.5 μl，Taq Buffer(10×)2 μl，MgCl2(25 mM)2 μl，Taq酶(5U·μl-1)0.2 μl，H2O18.3 μl。

氨氧化古菌(AOA)amoA基因引物Arch-amoAF(5′- STAATGGTCTGGCTTAGACG -3′)和Arch-amoAR(5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT- 3′)[11]。

氨氧化细菌(AOB)amoA基因引物amoA-1(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和amoA-2R(5′- CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[12]。反应条件为：95℃预变性3 min，94℃变性30 s、57℃退火30 s、72℃延伸30 s、72℃修复延伸8 min，共35个循环。

PCR产物电泳检测后通过割胶回收试剂盒纯化目的条带，TA克隆后进行克隆质粒的提取，提取过程参照生工质粒提取试剂盒SK8191 SanPrep。提取质粒后用紫外分光光度计测定质粒OD260值。通过公式换算成拷贝数(copies/μl)。

1.5.2 荧光定量PCR测定 通过荧光定量PCR仪(ABI7500)进行定量PCR扩增，各基因引物均与普通PCR引物相同，反应体系为10μl，包括SybrGreen qPCR Master Mix2X 5μl，引物F (10μM) 10μM 0.2μl，引物R (10μM) 10μM 0.2μl，ddH20 3.6μl，Template (DNA) 1.0μl，每10 μl体系加1 μl DNA模板。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性15 s、57℃退火20 s、72℃延伸30 s，共45个循环。完成上述步骤后，把加好样品的96/384孔板放在LightCycler480 Software Setup(Roche 罗氏)中进行反应。

1.5.3 土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮测定 土壤微生物生物量碳(Soil microbial biomass carbon,SMBC)、土壤微生物生物量氮(Soil microbial biomass nitrogen,SMBN)采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定[13]。

1.6 统计与分析

采用Excel 2007进行统计并用SPSS 21.0(IBM SPSS Statistical 21, SPSS Inc. Chicago，Illinois)进行方差分析和显著性水平检验(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 复种绿肥毛叶苕子对后茬作物产量的影响

2012—2019年油菜收获后复种绿肥减施化肥定位试验表明，处理F70+GT(翻压)产量最高，其次是处理F100+GR(留根茬),次之是处理F90+GR(留根茬)，高于单施化肥处理 5.05%～13.47%。在绿肥留根茬条件下，处理F100+GR(留根茬)比处理F100产量提高9.70%，处理F0+GR(留根茬)比处理F0产量提高7.56%，说明绿肥留根茬比不种绿肥增产效果好；在施70%化肥条件下，处理F70+GT(翻压)比F70+GR(留根茬)处理产量高，增产16.33%，说明翻压绿肥处理比绿肥留茬处理效果好；处理F70+GT(翻压)比100%化肥产量增加10.00%，处理F80+GR(留根茬)与100%化肥产量相当，也就是说翻压绿肥可减施化肥30%，绿肥留根茬可减施化肥20%，且油菜表现为增产(表1)。

表1 绿肥不同利用模式下后茬作物油菜产量的响应/(kg·hm-2)

复种绿肥，后茬作物小麦产量结果表明(表2)，处理F70+GT(翻压)产量最高，其次是处理F100+GR(留根茬),次之是处理F90+GR(留根茬),与油菜复种绿肥产量增产趋势相似。在绿肥留根茬条件下，处理F100+GR(留根茬)比处理F100产量提高10.12%，处理F0+GR(留根茬)比处理F0产量提高13.95%，说明绿肥留根茬比不种绿肥增产效果好；在施70%化肥条件下，处理F70+GT(翻压)比F70+GR(留根茬)处理产量高，增产15.93%，说明翻压绿肥处理比绿肥留茬处理效果好；处理F70+GT(翻压)比100%化肥产量增加10.43%，处理F80+GR(留根茬)与100%化肥产量相当，也就是说翻压绿肥可减施化肥30%，绿肥留根茬可减施化肥20%。

表2 绿肥不同利用模式下后茬作物小麦产量的响应/(kg·hm-2)

2.2 复种绿肥毛叶苕子对土壤理化性质及土壤微生物生物量碳氮的影响

长期单施化肥处理的土壤全氮、碱解氮、有机质、SMBC、SMBN含量与不施肥处理相比均略有增加(表3)，而在施用化肥基础上配施绿肥毛叶苕子，处理F100+GR、F90+GR、F80+GR、F70+GR、F60+GR、F70+GT土壤有机质、SMBC、SMBN均显著提高(P<0.01)，其中处理F70+GT土壤全氮、有机质、SMBC、SMBN为最高，比其他处理分别提高1.32%～13.90%，2.09%～13.28%，9.54%～35.77%，1.26%～26.33%。绿肥全量翻压处理(F70+GT)比根茬还田处理(F70+GR)土壤全氮、碱解氮、有机质、SMBC、SMBN含量增加明显，分别提高11.26%、0.10%、4.46%、9.62%、1.26%；绿肥配施化肥处理(F100+GR)比单施化肥处理(F100)土壤有机质、SMBC、SMBN含量增加明显，分别提高1.32%、11.13%、12.12%。

表3 不同施肥处理对土壤全氮、微生物生物量碳、微生物生物量氮的影响

2.3 复种绿肥减施化肥对氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)丰度的影响

以amoA基因为靶标，用荧光定量 PCR测定土壤AOA 数量，结果显示，不同处理AOA 平均数量为1.24×105～7.51×106拷贝数·g-1干土，其中F70+GT、F70+GR、F100+GR处理 AOA 数量显著高于其他6个处理(P<0.05)(图1)。在整个小麦生长周期内，土壤AOA 数量基本呈现先增加后减少趋势。小麦播种期土壤AOA 数量较低，为1.24×106～3.42×106拷贝数·g-1干土，至抽穗期土壤AOA 数量达到最高，变化幅度为3.24×106～7.51×106拷贝数·g-1干土，成熟期降到最低，为1.56×106～3.17×106拷贝数·g-1干土。

不同施肥处理下土壤氨氧化古菌(AOA)amoA基因的数量均明显高于氨氧化细菌(AOB)，化肥配施毛叶苕子土壤氨氧化古菌(AOA)、氨氧化细菌(AOB)数量明显高于单施化肥和不施肥处理。绿肥不论全翻压还是留根茬与化肥配施土壤氨氧化古菌(AOA)、氨氧化细菌(AOB)数量均有增加(图1、图2)。结果表明，AOA 是参与土壤环境中氨氧化过程的重要微生物，复种绿肥则增加了AOA、AOB数量，尤其是AOA数量增加明显，增加幅度为54.84%～72.51%。

图2 不同施肥处理土壤微生物AOB的响应Fig.2 Effects of different fertilization treatments on AOB

处理F70+GT与处理F70+GR相比较，绿肥全量翻压土壤微生物AOB拷贝数含量播种期、抽穗期显著高于根茬还田处理(P<0.01)，成熟期也有所提高；处理F100与处理F100+GR相比较，绿肥配施化肥处理比单施化肥处理土壤AOB拷贝数含量增加更明显；根茬各处理相比，其中处理F70+GR、F80+GR土壤AOB拷贝数含量较高。

2.4 氨氧化古菌与氨氧化细菌基因拷贝数的比值分析

氨氧化古菌与氨氧化细菌amoA基因的AOA/AOB比值被认为是评价土壤生态系统的潜在微生物指标[14]。土壤 AOA/AOB 数值在3.09～155.43(表4)，说明土壤硝化过程主要受 AOA 影响。空白对照F0与其他处理相比，施肥显著降低了各处理中AOA/AOB比值。处理F100+GR和F100相比，复种绿肥明显增加了AOA/AOB比值。

表4 氨氧化古菌与氨氧化细菌amoA基因拷贝数的比值

2.5 复种绿肥条件下氮转化功能基因与环境变量间相关关系

对土壤全氮(TN)、碱解氮(AN)、有机质(SOM)、微生物生物量碳(SMBC)、微生物生物量氮(SMBN)、氨氧化古菌(AOA)及氨氧化细菌(AOB)之间相关性进行分析，结果显示，土壤SMBC与SMBN、SOM与SMBC呈显著正相关关系，其余相关性不显著(表5)。

表5 氮转化功能基因与环境变量间的相关性

3 讨 论

3.1 长期复种绿肥可增加产量、减少化肥施用量

大量研究表明，轮作、复种可以提高作物产量，是种养结合的一项重要农业技术措施，增产幅度在10%～20%。本试验研究表明，长期麦后复种翻压绿肥可减施化肥30%，绿肥留根茬可减施化肥20%，且小麦、油菜增产。后茬作物小麦生育期施氮量减少 20%～30%时(157.5～180 kg·hm-2)与正常供氮水平(225 kg·hm-2)相比，产量不但没有降低,而且增加。说明复种豆科绿肥后，显著增加了土壤的氮库,有效减少了化肥氮的施用量。与单施化肥处理相比，复种绿肥处理提高了小麦氮肥利用率。这与李双来等[15]、袁家富等[16]的研究结果一致。

3.2 长期复种绿肥改变土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的数量

土壤AOB和AOA数量受氮的有效性[17]、温度[18]、土壤pH值[19]、土壤含水量[20]和施肥措施[21]等因素影响。有研究表明，在不同耕作制度和施肥条件下，旱地向水田转化后，AOA丰度增加，AOB丰度降低[22]，长期施用有机肥提高了稻田土壤AOB丰度[23]。本试验结果表明，绿肥不论全量翻压还是留根茬，与化肥配施土壤AOA、AOB数量均有增加，尤其是AOA在数量上远高于AOB。这与Leininger等[24]报道的原始土壤和农业土壤中AOA在数量上远高于AOB结果一致，本次试验再次证实了参与土壤环境中氨氧化过程的重要微生物是AOA。在整个小麦生长周期内，抽穗期土壤AOA、AOB数量达到最高,成熟期较低。这与水稻成熟期土壤AOA、AOB丰度均明显高于分蘖期和孕穗期结果不一致[25]。这可能是由于试验生态环境不同，与土壤水分、绿肥熟解速度、微生物变化等有关，需进一步深入研究青海高原旱地长期复种绿肥条件下土壤反硝化作用的变化情况。针对高原地区旱地AOA和AOB的研究报道相对较少，需要做更多的相关研究工作来验证有关科学问题。

3.3 长期麦后复种绿肥改变土壤微生物生物量碳、氮特征

30 a长期施用有机肥研究表明，与常规肥料相比，有机肥的施用增加了土壤有机质和微生物生物量碳[26-27]。复种绿肥毛叶苕子，较单施化肥提高了土壤SMBC、SMBN含量。这与研究结果绿肥与化肥配施显著提高土壤SMBN含量相一致[28]。全量翻压绿肥毛叶苕子、留根茬处理增加了微生物群落物种数量、优势种的优势度,这可能是由于绿肥的C/N有利于土壤微生物的生长，绿肥为微生物提供了较多的能源与养分，促进土壤微生物大量繁殖，加快微生物的新陈代谢[29]，从而提高了土壤SMBC、SMBN含量，改善了土壤理化性质，也是造成土壤中AOA、AOB数量变化的主要原因[30-31]。复种绿肥毛叶苕子显著增加了土壤全氮、SMBC与SMBN含量，为AOA提供了足够的碳源和能源，促进了AOA数量的增加，且AOA拷贝数与土壤SMBC、SMBN呈显著正相关关系，表明土壤SMBC、SMBN影响土壤AOA数量的变化。

4 结 论

在青海高原，长期种植翻压绿肥可减施化肥30%，绿肥留根茬可减施化肥20%，且小麦、油菜增产。长期种植绿肥显著改变了青海高原地区土壤AOA 、AOB数量及微生物量，进而影响土壤质量。化肥和绿肥配施的处理产量和生态效益要明显高于长期单独施用化肥或单施绿肥。本研究结果表明，绿肥不论全量翻压还是留根茬，与化肥配施产量增加、土壤AOA、AOB数量均有增加，尤其是AOA在数量上远高于AOB，表明不同土壤微生物丰度受种植模式、施肥量影响很大。研究不同绿肥利用模式、施肥量对土壤AOA、AOB数量的影响，有助于了解绿肥培肥土壤的机制，掌握土壤微生物群落结构的差异，将为青海高原农田土壤合理施肥提供科学依据。