苏卡达陆龟尿酸的固体成分和尿结石的性状及显微结构观察

丁荔佳,成 奇,潘连德,3 *,徐金铖,刘宇婷

(1.上海海洋大学 上海省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海 201306；2.上海绮异动物专科医院，上海 200335；3.上海海洋大学 国家水生动物病原库，上海 201306)

尿酸是苏卡达陆龟(Centrochelyssulcata)等爬行动物排泄含氮废物的主要成分，与陆龟尿结石的形成有着密切关系[1]，陆龟血液的尿酸指标能够评估陆龟的营养状况[2]，陆龟性别、种类、季节也影响尿酸的形成和排泄[3]。苏卡达陆龟、印度星龟(Geocheloneelegans)等几种易产生结石的沙漠型陆龟在正常代谢时存在排泄尿酸的行为[4]，其较大的膀胱有着储存尿液、浓缩尿液、循环利用水分的能力，与水龟、半水龟相比，沙漠型陆龟有着更大的膀胱，对尿液中水分重吸收的能力更强[5]。储存于野生和人工养殖陆龟膀胱中的尿酸会形成尿酸盐固体成分[1]，陆龟代谢正常时，尿酸盐固体成分会随着尿液排出体外，当陆龟代谢异常时，尿酸盐固体成分在尿结石核子如细菌、坏死细胞和组织等尿道异物的影响下会在膀胱内形成尿结石。微小的尿结石随着尿液排出体外，则不会影响陆龟的生长，否则，尿结石在膀胱中越长越大，就会患尿结石症。陆龟患尿结石症后，常表现出厌食、精神萎靡不振、不愿爬动、常做排便姿势但尿液和粪便排泄困难、后肢或泄殖腔肿胀等临床症状[2,6-7]。当较大的尿结石位于泄殖腔并堵塞尿道口或肛门口时，会导致粪便堵塞性肠梗阻，造成陆龟死亡[1-2,5,7-8]。尿石症最常见于生活在原始干旱气候环境中的陆龟，如苏卡达陆龟[1-2,7]、沙漠地鼠龟(Gopherusagassizii)[6,9]常发此症。通过X射线和 CT影像学技术检验，可查明尿结石在陆龟体腔中的位置、大小及其数量[2]。临床实践中，通过中指自泄殖孔插进泄殖腔并触摸内容物，或双手指通过后肢股前窝触摸体腔，也可初步检查尿结石及其大小。陆龟患尿结石症后通常需要外科手术，根据病龟大小、尿结石在病龟体腔中的位置和大小，可选用泄殖腔碎石手术[7]、腹部开甲手术[1,5,8,10]、跨窝软组织切开术[2,7]等方法去除尿结石。尿结石取出来后，可通过定性定量多种分析方法测定其成分[11]以揭示尿结石的属性。为深入了解苏卡达陆龟尿酸和尿结石的性状和结构开展本研究，以期为陆龟人工养殖和尿石症的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及其尿酸和尿结石样品的采集、处理和保存尿酸样品采自海南省海口泓旺农业养殖公司的 20只人工养殖苏卡达陆龟(图1A)，体宽 45 cm 左右，体长 54 cm左右，体质量约30 kg，成年种龟编号 1～20号(图1A)。苏卡达陆龟及其尿结石来自上海绮异动物专科医院，编号为 21 号(图2A)和 22 号，均为雌性，体质量为 2.8 kg，病龟均厌食多日，精神萎靡不振，泄殖腔肿胀，多日未排除尿酸和粪便。在晴天上午 8:00-10:00 和下午 2:00-4:00 采集2次样品，用吸管吸取刚排出未被污染的尿酸，手术刀刮去表面污染区域后，汤勺挖取牙膏状尿酸；对于自然条件下风干的尿酸样品，采集时挑选形态较为完整，未被污染的部分，再用自来水清洗过滤除去杂质后暂存于 50 mL的离心管中。对采集后的样品预处理和临床观察，挑选出20 份，依次编号1～20 号，常温保存。样品带回实验室后，经 80℃立式鼓风干燥箱(HTG-9240A)内干燥 24 h，从中选出3类(图1B,C,D)6 个尿酸样品(3，4，5，6，7，15 号)，对样品进行观察、采集照片和汇总特征。21号和22号苏卡达陆龟患尿结石症后，通过 X光照片确定尿结石在病龟体内的位置、大小(图2B)，然后在无菌环境中进行腹部开甲手术取石(图2C)。术后取出的尿结石用自来水冲洗，去除污物及血渍，称测质量，分割，取其体积的 1/8，用手术刀和镊子将21号样品按照“树轮”由外到内分层剥离成10层暂放于培养皿中，核心层记为 Core，核心层由内到外按层依次记为L1～L10(图3)。

A.3 号苏卡达陆龟一边进食一边排尿酸(↑);B.苏卡达陆龟液体或胶状尿酸(↑)；C.苏卡达陆龟半固体或牙膏状尿酸(↑)；D.苏卡达陆龟自然风干后的尿酸固体(←)

A.患尿结石症的 21号苏卡达陆龟;B.X光照片显示出尿结石(←)；C.膀胱中尿结石(←)；D.取石手术后的状态

Core.核心层为空；L1.第1层；L2.第2层；L3.第3层；L4.第4层；L5.第5层；L6.第6层；L7.第7层；L8.第8层；L9.第9层；L10.第10层，即最外一层。放大倍数.4.16倍

1.2 苏卡达陆龟尿酸的固体成分和尿结石扫描电镜样品处理及观察尿酸的固体成分和 21号尿结石分层样品及 22号尿结石随机样品处理为 0.3 cm3的小块，置于扫描电镜样品盘上的导电胶固定(图4A,C)；将样品放入离子溅射装置(E-1010，日立)内抽真空，电压控制在 4 V 以下，16 min 后进入喷金模式(图4B,D)，50 s 后将样品取出置于扫描电子显微镜(S3400，日立)载物台中，调试参数，观察并采集图片。

A.固定于扫描电镜样品盘导电胶上的 6 个尿酸固体成分和 2 个尿结石样品；B.喷金后的 8 个样品；C.固定于扫描电镜样品盘导电胶上的 21 号尿结石分层样品；D.喷金后的 21 号分层样品

2 结果

2.1 苏卡达陆龟尿酸及其固体成分性状和结构

2.1.1尿酸及其固体成分眼观性状和结构 苏卡达陆龟排出的尿酸有白色、乳白色、黄色等颜色，其形态各异，有的稀薄、有的黏稠呈半固体状。尿酸放置在样品管中会形成半固体或固体(图5A,C)，在自然状态下风干会形成固体(图5E)，高温干燥后全部形成固体(图5B,D,F)，其质地松脆，颜色略有改变(表1)。

A.干燥前的 15 号样品,部分表面呈黄色(↑)；B.干燥后的 15 号样品，部分边缘呈微黄色(↑);C.干燥前的 3 号样品，部分边缘呈卷曲状(←)；D.干燥后的 3 号样品；E.干燥前的 5 号样品，部分剖面呈淡黄色(←)；F.干燥后的 5 号样品，部分剖面呈淡黄色(←)

表1 6个苏卡达陆龟尿酸及其固体成分样品的形态变化

2.1.2苏卡达陆龟尿酸固体成分的扫描电镜结构特征 在扫描电镜 24倍镜下，6个尿酸样品的固体成分均为表面粗糙石块状(图6A)。在 100倍和 500倍镜下，3号样品为片状和颗粒状结构混合物(图6B)，4号样品为片状和石砾状结构混合物(图6C)，5号样品为片状和颗粒状结构混合物(图6B)，6号样品为颗粒状结构混合物(图6D)，7号样品为火山岩状结构(图6E)，15号样品为颗粒状结构混合物(图6D)。在 1 000～4 000倍镜下，3号样品为煤渣状结构混合物(图6F)，4号样品为碎石状结构(图6G)，5号样品为片状(图6H)和煤渣状结构混合物(图6F)，6号样品为海绵状结构(图6I)，7号样品为海绵状结构(图6I),15号样品为煤渣状结构混合物(图6F)。

A.3号样品，24×，表面粗糙石块状；B.3 号样品，500×，片状和颗粒状结构混合物;C.4 号样品,500×,片状和石砾状结构混合物；D.6 号样品,100×，颗粒状结构混合物;E.7 号样品，500×，火山岩状；F.3 号样品，2 000×，煤渣状结构；G.4 号样品，2 000×，碎石状结构;H.5号样品，2 000×,片状结构;I.6 号样品，3 000×，海绵状结构

2.2 苏卡达陆龟尿结石性状和结构

2.2.1苏卡达陆龟尿结石眼观性状及结构 21号苏卡达陆龟尿结石刚取出时，形态呈圆球状，比乒乓球稍大，直径 50 mm，质量 40 g(图 7A)；22 号样品呈椭圆形状，长径 58 mm，短径 53 mm，质量 45 g。尿结石表面粗糙，如同月球表面，质地硬。21号尿结石取出后用钢锯对其按总体积的1/2切割(图7B)、1/4切割、1/8切割(图7C)切开，用自来水冲洗后的剖面呈树轮状分层，表面有大量分布不均的空隙，每层尿结石面积不均，形态各异，由灰色、白色、乳白色、少量浅红色、淡黄色等颜色组成，核心层(Core)为空，由内到外按层依次记为 L1～L10，在解剖显微镜(OLYMPUS，SZ61)4.16 倍观察分层结构(图3)。

A.手术取出的尿结石和乒乓球合照；B.1/2切割清洗过的尿结石(中间)；C.1/8切割清洗过的尿结石

2.2.2苏卡达陆龟尿结石的扫描电镜结构特征 在扫描电镜 24倍镜下, 21号苏卡达陆龟尿结石分层样品 L1～L10及 22号尿结石随机样品均为表面粗糙石块状(图 8A)。在 100倍和 500倍镜下，L1层为泥沙和颗粒状结构混合物(图 8B)，L2层为泥沙和网状结构混合物(图 8C)，L3-L7层为泥沙和煤渣状混合物(图8 D)和珊瑚石状结构(图8 F)，L4层为泥沙状混合物(图 8E)，L5层为珊瑚石状结构(图 8F)，L6层为泥巴和泥沙混合物(图 8G)，L8层为泥巴和泥沙混合物(图8G)及泥沙状混合结构(图8E)。500倍镜下，22号样品随机层为煤渣状结构(图8H)。在1 000～4 000倍镜下，L5层为海绵状结构(图 8I),L9层为紫菜状结构(图 8J)，L10层为煤渣状和纤维状混合结构(图8K),L3 层为海绵状结构(图8L)。

A.21号样品，L2层，24倍，表面粗糙石块状；B.21号样品，L1层，500×,泥沙和颗粒状结构混合物；C.21号样品，L2层，500×,泥沙和网状结构混合物；D.21号样品，L3层，100×,泥沙和煤渣状混合物；E.21号样品，L4层，×100,泥沙状混合物；F.21号样品，L5层，500×,珊瑚石状结构；G.21号样品，L6层，100×,泥巴和泥沙混合物；H.22号样品，随机层，500×,煤渣状结构；I.21号样品，L5层，4 000×,海绵状结构;J.21号样品，L9层，1 000×,紫菜状结构;K.21号样品，L10层，2 000×,煤渣状和纤维状混合结构;L.21号样品，L3层，1 000×海绵状结构

3 讨论

3.1 苏卡达陆龟尿酸及其固体成分和尿结石的特征陆龟尿液中会积累大量的尿酸，和尿液一样尿酸也是陆龟[9]、蜥蜴、蛇、鳄鱼[12]等爬行动物排氮的主要形式，其尿酸在尿液中积累、转化后会形成尿酸盐或固体颗粒，受尿液pH的影响，尿酸以液体状尿酸或半固体尿酸盐的形式排出体外[13]。由于尿酸成分及其浓度的变化，新鲜尿酸排泄物会有豆浆状、胶状、牙膏状、石砾状等各种各样的形态，尿酸排出后，经自然风干或高温干燥后会变成表面粗糙的石块状。在扫描电镜下，尿酸固体成分有表面粗糙石块状、片状、颗粒状、石砾状、细沙状、火山岩状、泥巴状、煤渣状和海绵状等多样化结构特征，与犬的4种尿结石的性状和扫描电镜结构不同[14]。苏卡达陆龟膀胱中的尿结石呈球体或椭圆形状[1,2,5]，表面粗糙，质地松散，有大量分布不均的空隙，剖面像树轮一样逐层增长；每层尿石面积不均，形态各异[2]，由乳白色、黄色、棕色等多种颜色组成，与军曹鱼(Rachycentroncanadum)[15]膀胱中的尿结石形态相似。

3.2 苏卡达陆龟尿酸的固体成分及其尿结石的关联苏卡达陆龟将尿酸和尿液储存在膀胱中，缺水时，若其膀胱内的尿酸和尿酸盐不能及时排出体外就会在体内积聚形成尿结石[7]。苏卡达陆龟尿酸固体成分为质地松脆易碎的不规则固体、颗粒状固体、团状固体及块状固体，其中粉砂状和颗粒状的形态与波尔山羊和水牛膀胱结石形态类似，与质地坚硬、外观呈球形或椭圆形、内部结构呈树轮状分层[2]的苏卡达陆龟尿结石形态存在差异。在扫描电镜下，苏卡达陆龟尿酸样品固体成分结构与尿结石各层扫描电镜结构有部分相似之处，但苏卡达陆龟尿结石无片状、石砾状、细沙状、火山岩状等结构，其主要原因是苏卡达陆龟尿结石在膀胱内的形成是由无数尿酸盐和尿结石形成因子共同组成，而尿酸盐是尿酸的主要固体成分[16-19]。波尔山羊尿结石由少量柱状晶体和多种形态的颗粒混合物组成[20]，水牛尿结石由细小颗粒和斜方柱状晶体混合组成[20-21]，与苏卡达陆龟尿结石扫描电镜结构不同。

3.3 苏卡达陆龟尿酸的健康管理和预防尿结石的临床建议苏卡达陆龟对于养殖环境中的温度、湿度、光照和食物有独特的要求，它们依靠环境的热量和自身行为来调节适宜体温。在日常管理中，建议环境温度保持在 26～30℃，湿度保持在 40%～80%，食物以高纤维、高钙、低磷、低蛋白、低水分的水果蔬菜为主。为促进陆龟对钙质的吸收，饲养场应配备全光谱太阳灯，天气好时带龟晒太阳，做运动，在龟场水池泡澡，以促进陆龟排出尿酸，避免形成尿结石。日常管理应注意观察苏卡达陆龟排除尿酸的数量和性状，若发现有尿酸排泄减少、有尿结石颗粒排出或状态不好的情况，应对其仔细检查，及时排除病因，以防止尿石症发生，苏卡达陆龟一旦确诊为尿石症，应及时就医[2,5]。