捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药株和敏感株转录组水平下差异基因分析

石雅琴，苏 倩，王腾宇，毛晓伟，陈昕迪，穆嘉明，王文龙*，刘春霞

(1.内蒙古农业大学 兽医学院 农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学 生命科学院，内蒙古 呼和浩特 010018)

捻转血矛线虫是家畜最常见的胃肠道寄生虫之一，主要以吸食宿主血液为生，导致宿主出现贫血、消瘦、皱胃黏膜损伤等症状[1-2]，寄生严重者可致宿主死亡，特别是幼龄宿主。目前，捻转血矛线虫对伊维菌素、丙硫咪唑、左旋咪唑等均出现了耐药性[3-4]。丙硫咪唑作为一种广谱、高效、低毒的苯并咪唑类抗蠕虫药物，广泛应用于国内畜禽蠕虫病的临床防治，在一定程度上促进了我国畜牧行业的发展[5]。但是，耐药性的产生，在一定程度上给养殖业带来严重威胁，导致巨大的经济损失。传统的耐药性检测方法是在产生了明显的耐药性之后才能进行检测，因此，探索一种新的耐药性检测方法势在必行，而关于捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药性的转组学研究尚未见报道[6-7]。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分析作为一种新型基因研究手段，对遗传疾病、物种进化、药物设计与应用、种群多样性、肿瘤标志性变化[8]及法医学等方面的研究有重要意义。SNP是单个碱基序列发生突变，因此会直接影响氨基酸序列，导致蛋白质的结构功能发生改变，因而SNP位点可能是疾病遗传机制研究的重点方向[9-11]。据报道，1991年对荷兰羊场进行驱虫药耐药性调查，发现出现了芬苯咪唑耐药性，之后便停止使用了该药物；5年之后，再次使用该药物，发现该羊场的圆线虫依然对其具有耐药性[12-13]，这说明耐药性具有相对稳定性。HOEKSTRA等[14]对左旋咪唑耐药性选择遗传进行研究，发现左旋咪唑的耐药性在连续的线虫世代中逐渐发展。有些线虫一旦产生耐药性，后期即使不再用该药，若干代后也很难恢复对该药的敏感性，这更加证实耐药性是一种遗传性状。而SNP分析对于捻转血矛线虫耐药机制的研究和新药物研发有重要意义。本试验从不同地区羊群中采集丙硫咪唑敏感和耐药虫株，根据转录组数据进行耐药相关基因SNP分析，确定耐药性相关SNP突变，并对其基因进行生物信息学分析、PCR扩增以及测序分析。

1 材料与方法

1.1 捻转血矛线虫试验虫株捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药虫株(Hc-WSrBZ1、Hc-WSrBZ2)采自内蒙古自治区鄂尔多斯市乌审旗；捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药虫株(Hc-CYrBZ)和临床敏感虫株(Hc-CYsBZ)采自内蒙古自治区乌兰察布市察右后旗；捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药虫株(Hc-XArBZ)采自内蒙古自治区兴安盟科右前旗；捻转血矛线虫标准敏感虫株(Hc-ssBZ)为内蒙古农业大学兽医学院王瑞教授实验室友情馈赠。所有虫株均在体视镜下鉴定雌虫和雄虫后，做好标记后于液氮中保存。

1.2 主要试剂及仪器RNA提取试剂TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反转录试剂盒和PCR扩增用试剂购自TaKaRa公司。小型台式高速离心机(1-14)，德国Sigma公司产品；低温高速离心机(5430R)，德国Eppendorf公司产品；PCR仪(2720 Thermal Cycler)，Applied Biosystems公司产品；水平凝胶电泳仪(BG-subMIDI)，北京百晶生物技术公司产品；BDA凝胶成像仪(BDA digital)，美国BioDocAnalyze公司产品。

1.3 捻转血矛线虫耐药相关SNP基因筛选以捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药虫株(Hc-XArBZ)和标准敏感虫株(Hc-ssBZ)转录组数据进行SNP比较分析，选取非同义突变且发生在外显子区域的基因，以敏感虫株为参照，耐药虫株发生突变为选择依据，确定耐药相关候选基因。

1.4 突变基因生物信息学分析使用DNAstar 7.1.0软件将4个基因翻译成氨基酸序列，应用在线软件ExPASy-Prot Param分析4个基因编码产物的氨基酸序列组成及理化性质[15]；SOPMA在线软件分析蛋白质的二级结构；SWISS-MODEL预测基因编码蛋白的三级结构[16]等。

1.5 试验样品RNA提取及cDNA合成取捻转血矛线虫第3期幼虫，经DEPC水清洗后，放入预冷的研钵中加入液氮研磨，取研磨后组织置于1.5 mL的离心管中，加入 800 μL的TRIzol试剂，充分混匀，室温静置5～10 min；加入 200 μL氯仿，盖紧离心管盖，轻微混匀至乳化，室温静置5～10 min；4℃、13 000 r/min 离心15 min，小心取出离心管，取上清液移入另一新的离心管中；向上清液中加入等体积的异丙醇，轻微的上下颠倒混匀，冰上静置10～20 min；4℃、13 000 r/min离心10 min，弃上清，加入 1 mL 75%酒精(DEPC水配制)，轻微上下颠倒洗涤，4℃、8 000 r/min离心10 min，弃上清，将离心管倒置在滤纸上，自然风干 5 min；沉淀干燥后，加入10～20 μL RNase-free水，室温促溶 2 min后，使用NanoDrop2000测定RNA的浓度和纯度。将测定后的RNA按照TaKaRa公司反转录试剂盒说明书操作反转录为cDNA。

1.6 差异基因PCR扩增根据从转录组数据中筛选出的HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等 4 个基因序列，利用Primer 5软件设计特异性引物，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列：HCON_00192020上游引物P1：5′-CCAAGGTTGATCACAGCGAATG-3′，HCON_00192020下游引物P2：5′-GGCCGAAACTATTGTCT-3′；HCON_00037800上游引物P3：5′-CCGAAGGCTAAACGACCATGTC-3′，HCON_00037800下游引物P4：5′-TGCTTTGCGAAGACGATTCTG-3′；HC-ON_00129090上游引物P5：5′-TGTCGACGTCAAGAACAATAGA-3′，HCON_00129090下游引物P6：5′-CGGCTGGAACAGAGTTACAT-3′；HCON_00178650上游引物P7：5′-ATGGAAATTCACGAACAAGGA-3′，HCON_00178650下游引物P8：5′-CTAAAACCTTTCATCTGCAGTG-3′。PCR扩增反应体系25 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，50～55℃ 30 s(HCON_00192020退火温度为 50℃；HCON_00037800退火温度为 55℃；HCON_00129090退火温度为 52℃；HCON_00178650退火温度为 55℃)，72℃ 1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。将PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.7 PCR产物测序分析将扩增条带大小正确的4个基因的PCR产物送北京六合华大基因科技有限公司进行测序分析。

2 结果

2.1 捻转血矛线虫耐药相关SNP基因筛选以捻转血矛线虫丙硫咪唑耐药虫株(Hc-XArBZ)和标准敏感虫株(Hc-ssBZ)转录组数据进行SNP比较分析，选取非同义突变且发生在外显子区域的基因，以敏感虫株为参照，耐药虫株发生突变为选择依据，筛选耐药相关候选基因。共筛选到41个具有SNP位点的基因，选择reads≥10的4个基因进行后续基因扩增和生物信息学分析。

2.2 差异基因生物信息学分析结果

2.2.1理化性质分析 将4个基因序列用DNAStar中EditSeq软件翻译为氨基酸序列后，经ExPASy-Prot Param分析发现：4个基因敏感株和耐药株的原子总数、分子式和相对分子质量分别有不同程度的改变。HCON_00192020基因敏感株蛋白质不稳定系数为37.93(<40为稳定蛋白)，总平均亲水性为―0.370。耐药株蛋白质不稳定系数为38.18，总平均亲水性为―0.383。HCON_00037800基因敏感株蛋白质不稳定系数为48.14，总平均亲水性为―0.441。耐药株蛋白质不稳定系数为48.36，总平均亲水性为―0.430。HCON_00129090基因敏感株蛋白质不稳定系数为61.28，总平均亲水性为―0.495。耐药株蛋白质不稳定系数为61.72，总平均亲水性为―0.505。HCON_00178650基因敏感株蛋白质不稳定系数为42.69，总平均亲水性为0.157。耐药株蛋白质不稳定系数为42.97，总平均亲水性为0.147。

2.2.2蛋白二级结构预测 应用SOPMA程序预测蛋白的二级结构，敏感虫株和耐药虫株HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因所编码蛋白二级结构组成均发生改变见表1，突变前和突变后见图1。

A,a.HCON_00192020;B,b.HCON_00037800;C,c.HCON_00129090;D,d.HCON_00178650;大写字母表示敏感虫株，小写字母表示耐药虫株(下同);蓝线表示α螺旋；紫线表示无规则卷曲；红线表示延伸链；绿线表示β转角

表1 4个基因编码蛋白二级结构组成

2.2.3蛋白三级结构预测 应用SWISS-MODEL在线软件预测敏感株和耐药株HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因编码蛋白的三级结构(图2)。其中，敏感虫株和耐药虫株HCON_00192020和HCON_00037800基因编码蛋白结构发生明显改变，红色箭头表示三级结构改变位置；而HCON_00129090和HCON_00178650基因编码蛋白其二级结构发生改变，三级结构未见明显改变。

A,a.HCON_00192020；B,b.HCON_00037800；C,c.HCON_00129090；D,d.HCON_00178650

2.3 差异基因扩增结果采用RT-PCR方法，根据HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等 4个基因不同的PCR反应条件，对捻转血矛线虫1个标准敏感虫株和3个耐药虫株分别进行RT-PCR扩增，扩增结果电泳图见图3，目的条带大小均正确，可用于后续测序分析。

A.HCON_00192020;B.HCON_00037800;C.HCON_00129090;D.HCON_00178650;M.DL2000 DNA Marker;1.标准敏感虫株;2～4.3个地区耐药虫株

2.4 差异基因扩增产物测序分析根据4个基因在4个不同样本中PCR产物测序结果，利用DNAstar中Megalign软件，进行捻转血矛线虫标准敏感虫株与3个耐药虫株测序序列的两两比对。HCON_00192020基因在3个耐药虫株中第266位均由T突变为C；HCON_00037800基因在3个耐药虫株中，第179、182、188位均由A突变为G；HCON_00129090基因在3个耐药虫株中第283位由G突变为A；HCON_00178650基因在3个耐药虫株中第89位均由C突变为A。突变结果均与转录组测序结果一致。

3 讨论

目前，对于捻转血矛线虫耐药性的检测仍然是以传统方法为主，转录组学的迅猛发展为捻转血矛线虫耐药性检测提供了新思路。因此，本试验从转录组水平出发，对捻转血矛线虫耐药性进行了初步探索。

本试验首先根据捻转血矛线虫转录组测序数据筛选出HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650等4个与耐药相关候选差异基因。4个差异基因序列经NCBI中BLAST比对，分析其所编码蛋白的结构域，HCON_00192020基因编码蛋白结构域为C1肽酶家族，也称为木瓜蛋白酶家族，由半胱氨酸肽酶(CPs)的2个亚家族C1A(木瓜蛋白酶)和C1B(博来霉素水解酶)组成。而组织蛋白酶B是一种木瓜蛋白酶样半胱氨酸肽酶[17]，属于溶酶体，在所有组织中均有表达，它与其他组织蛋白酶一起，参与蛋白质降解、酶原活化、抗原加工、代谢和细胞凋亡等。HCON_00037800基因编码蛋白存在WD40结构域，该结构域存在于许多真核生物蛋白中[18]，这些蛋白家族均具有多种功能，包括信号转导、mRNA前加工和细胞骨架组装配制中的衔接作用或调控作用等。HCON_00129090基因编码蛋白注释到锌指蛋白家族，锌指蛋白是真核生物中较为丰富的一类转录因子[19]，指含有通过结合锌离子形成稳定的可以自我折叠形成类似于“手指”结构的一类蛋白，在胚胎发育和细胞分化等生命过程中发挥重要作用。HCON_00178650基因编码蛋白结构域为主要促进者超家族(MFS)。MFS家族在细菌、真核生物中普遍存在[20]，是一个庞大而多样的次级转运者群体，包括单向转运蛋白、同向转运蛋白和反向转运蛋白。MFS蛋白能促进跨越多种底物的细胞质或内膜上进行运输，这些底物包括离子、磷酸糖、药物、神经递质、核苷酸、氨基酸和多肽。单向转运蛋白转运单个底物，而同向转运蛋白和反向转运蛋白可以分别沿膜的相同或相反方向转运2种底物。其次，对这4个差异基因进行了生物信息分析，在了解了其编码蛋白主要理化性质后，对其进行了二级结构和三级结构预测。理化性质预测结果显示，HCON_00192020基因编码的蛋白是稳定的亲水性蛋白；HCON_00037800基因编码的蛋白是不稳定亲水性蛋白；HCON_00129090基因编码的蛋白是不稳定亲水性蛋白；HCON_00178650基因编码的蛋白是不稳定疏水性蛋白。但敏感虫株与耐药虫株这4个基因编码蛋白原子总数、分子式及相对分子质量等均发生了改变。二级结构和三级结构预测结果显示单个碱基发生改变，导致敏感虫株和耐药虫株蛋白质的空间结构发生了变化，对应的功能也有可能发生改变，例如镰刀型贫血症，就是典型的单核苷酸突变，致使氨基酸序列发生改变，血红蛋白结构异常[21]，从而引起的一种疾病。所以也可以大胆的推测这些改变具有导致耐药性产生的可能性。最后，对这4个差异基因进行PCR扩增，对条带大小正确的扩增产物进行测序。将测序得到的标准敏感虫株与3个地区不同的耐药虫株序列进行比对，结果发现该4个差异基因在3个不同地区耐药虫株中均有相应位点发生单核苷酸突变，且与转录组测序所得的突变位点信息一致，证明了HCON_00192020、HCON_00037800、HCON_00129090和HCON_00178650基因可作为捻转血矛线虫耐丙硫咪唑虫株的分子标记，用于耐药虫株的分子鉴定。