当归内酯对鸡新城疫疫苗免疫效价、免疫细胞及相关因子的影响

张余蓬，邓华英，李前勇,2*，张德志,2，朱 瑞

(1．西南大学 动物医学院，重庆 荣昌 402460；2．重庆市兽医科学工程研究中心，重庆 荣昌 402460)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由ND病毒强毒引起禽类的一种急性高度接触性传染病，属于OIE规定必须报告的疫病和国家农业部规定的一类动物疫病[1]。多年来，我国一直坚持以免疫预防为主，不断完善生物安全体系建设的防控思路，使本病的感染率总体维持在较低水平。但在我国局部地区ND污染还比较严重，一些鸡场免疫接种后抗体效价低或抗体滴度高低不一、离散度较大，难以抵抗野毒侵袭，ND疫情呈现持续性地方流行或散发[2-3]。在疫苗免疫为主导的ND防控中，ND灭活疫苗不能有效刺激细胞免疫，弱毒疫苗长期使用可能发生疫苗毒株基因重组、抗原变异，甚至毒力返强[4]，无疑会增加ND扩散的范围，加大防控的难度。为此，在常规疫苗免疫中使用免疫佐剂或免疫增强剂，增强ND疫苗效果、减少抗原的使用量和接种次数，十分有意义。

禽用疫苗佐剂主要有天然植物提取物、铝盐、油乳剂、细胞因子及其他新型佐剂几类，其中天然植物中提取的某些组分具有免疫调节活性强、毒性低、易代谢等优势，格外引人关注。已有研究证实，黄芪多糖作为ND灭活苗的佐剂可减少抗原使用剂量、增强疫苗免疫水平，疫苗免疫期间饲喂可显著提高ND弱毒苗的血清抗体水平[5-6]；以0.5～1.0 mg每只肌肉注射板蓝根多糖，可显著提高ND弱毒疫苗的免疫效价[7]，怀牛膝多糖、枸杞多糖、人参皂苷等在ND疫苗免疫中也具有提高抗体效价、延长免疫期作用[8]。但上述报道的天然植物提取物，存在药材昂贵、大量提取使用困难，或作为佐剂使用制作工艺复杂，难以实现生产使用。当归内酯(α-angelica lactone，α-AL)为当归根提取物，属于当归挥发油中的成分，人们已实现对其有机合成、量产[9-10]。有研究资料表明[11-12]，α-AL在小鼠体内外试验均有增强免疫功能的作用，但尚未见该物质对鸡ND疫苗免疫作用报道。本试验开展了α-AL对鸡ND疫苗免疫作用效果及部分机制的研究，以期为该物质作为鸡ND疫苗免疫佐剂或增强剂的开发应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料健康青脚麻鸡，购于荣昌区某家鸡养殖场。当归内酯(α-AL)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、1%台盼蓝染色液等均购自上海嵘泰医药科技有限公司，新城疫Ⅳ系(LaSota株)弱毒苗购自广东温氏大华农生物科技有限公司，RPMI 1640培养液、胎牛血清、双抗等购自Gibco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，鸡新城疫血凝抑制试验阳性血清购自哈尔滨国生生物科技有限公司，鸡淋巴细胞分离液、鸡T淋巴细胞CD4+酶联免疫分析试剂盒、鸡T淋巴细胞CD8+酶联免疫分析试剂盒购自上海素尔生物科技有限公司；反转录试剂盒(RR037A)、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ购自TaKaRa。

1.2 分组与处理第1批240只7日龄青脚麻鸡随机分为6组，Ⅰ组为空白，Ⅱ组为疫苗对照，Ⅱ～Ⅵ组在14，28日龄接种ND疫苗各1剂，Ⅲ～Ⅵ组于接种前连续皮下注射α-AL 3次，剂量分别为10，20，40，80 mg/(kg·d-1)，Ⅰ、Ⅱ组注射等量生理盐水。各组于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d采心血，分离血清，检测ND抗体效价；剖取免疫器官，测定免疫器官指数。第2批120只7日龄青脚麻鸡随机分为4组，Ⅶ组为空白，Ⅷ组为疫苗对照，Ⅷ～Ⅹ组于14，28日龄接种ND疫苗，Ⅸ组在免疫前连续3 d 皮下注射α-AL最佳剂量，Ⅹ组在免疫前连续5 d 注射α-AL最佳剂量，每日1次，Ⅶ、Ⅷ组注射等量生理盐水。各组于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d采心血，分离血清，测定血液中T淋巴细胞亚群数量；无菌取脾脏，做脾淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测。

1.3 血清ND抗体效价测定Ⅰ～Ⅵ组分别于免疫前和免疫后7，14，21，28，35 d无菌采心血2 mL，静置4 h，分离血清，4℃保存。用血凝抑制试验测定各组ND抗体水平[13]。

1.4 免疫器官指数测定Ⅰ～Ⅵ组分别于免疫后7，14，21，28，35 d随机抽取5只鸡测体质量，取胸腺、脾脏、法氏囊，并去除脂肪，用滤纸吸去表面液体，称量鲜重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官鲜质量(mg)/宰前空腹体质量(g).

1.5 脾脏T、B淋巴细胞增值测定二免后14 d Ⅶ～Ⅹ 每组取5只鸡解剖，无菌取脾脏，按试剂盒方法测定。 刺激指数(SI)=D刺激管/D对照管。

1.6 血液T淋巴细胞亚群测定将Ⅶ～Ⅹ组分离的血清用ELISA试剂盒检测CD4+、CD8+淋巴细胞数量，并计算其比值。

1.7 细胞因子mRNA相对表达量的测定免疫后7，14，21，28 d，Ⅷ～Ⅹ各组取5只鸡，无菌取脾脏，按试剂盒方法提取总RNA。按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行反转录。参照GenBank中鸡GAPDH保守序列设计上、下游引物，参考文献[14]设计IL-2、IL-4引物(表1)。引物由上海生工合成。用PCR检测cDNA第1链质量，总反应体系为25.0 μL，其中GAPDH上游引物1.0 μL，GAPDH下游引物1.0 μL。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32个循环，再72℃总延伸5 min， 4℃保存，扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。以cDNA为模板，进行qPCR，反应体系为20 μL，其中2×SYBR Premix EX Taq Mix 10 μL，QF(10 μmol/L) 0.5 μL，QR(10 μmol/L) 0.5 μL，Template cDNA 2.0 μL，RNase Free ddH2O 7.0 μL。反应条件为94℃预变性，94℃变性5 s，61℃退火35 s，40个循环。采用2-△△Ct计算相对表达量。

表1 鸡细胞因子qPCR扩增引物

1.8 统计分析试验数据采用SPSS 17.0进行单因素方差分析和LSD多重比较分析。

2 结果

2.1 血清抗体效价变化表2可知，免疫前各组差异不显著(P>0.05)；试验期间，试验组抗体效价均高于空白对照组。接种后7，21 d，与疫苗对照组比较α-AL试验各组均呈上升趋势，其中，Ⅳ组显著高于空白对照、疫苗对照和α-AL其他试验组(P<0.05)。28，35 d后，疫苗组及α-AL试验各组显著高于空白对照组(P<0.05)，但疫苗组与α-AL试验各组间无显著性差异。结果表明，α-AL注射可提高鸡ND抗体的效价，以20 mg/kg剂量效果最佳。

表2 免疫后不同时间α-AL对鸡ND抗体效价的影响

2.2 免疫器官指数变化如图1所示，免疫后7 d，Ⅵ组胸腺指数最高，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组均低于Ⅰ、Ⅱ组；免疫后14，21，28，35 d试验组胸腺指数均高于空白对照组，免疫后14，21，35 d，Ⅵ组高于Ⅱ组；免疫后14，21，28 d，Ⅳ组高于Ⅱ组；但所有参试组间差异不显著(P>0.05)。

图1 α-AL对鸡胸腺指数的影响

如图2所示，免疫后14，21，28 d，各组脾脏指数呈上升趋势，28 d达到最高峰，试验组比对照组上升趋势更明显。免疫后14，21，28，35 d，Ⅵ组脾指数稳定。免疫后21，28，35 d，Ⅳ组脾脏指数高于其余组；免疫后28，35 d，Ⅲ～Ⅴ组脾脏指数高于Ⅵ组，Ⅳ组的脾指数增加最明显。α-AL试验组脾脏指数均高于空白及疫苗组，但差异均不显著(P>0.05)。

图2 α-AL对鸡脾脏指数的影响

如图3所示，α-AL各组法氏囊指数均高于空白及疫苗对照组；其中免疫后7 d，Ⅳ组显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05)，其余免疫后采样时间点α-AL各组与空白及疫苗对照组间均无显著性差异(P>0.05)。

*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.3 脾脏T、B淋巴细胞增值变化如图4所示，二免后2周，Ⅸ、Ⅹ组T淋巴细胞刺激指数极显著高于Ⅶ、Ⅷ组(P<0.01)，Ⅹ组T淋巴细胞刺激指数显著高于Ⅸ组(P<0.05)，Ⅶ、Ⅷ组差异不显著(P>0.05)。Ⅹ组B淋巴细胞刺激指数高于Ⅶ、Ⅷ组且差异极显著(P<0.01)，Ⅹ组与Ⅸ组差异不显著(P>0.05)，Ⅸ与Ⅷ组差异不显著(P>0.05)，而与Ⅶ组差异极显著(P<0.01)，Ⅶ、Ⅷ组差异不显著(P>0.05)。结果表明，免疫前连续注射α-AL 5 d，对鸡T、B淋巴细胞增殖效果最好。

图4 T、B淋巴细胞增殖动态变化

2.4 T淋巴细胞亚群变化

2.4.1CD4+T淋巴细胞亚群含量变化 由表3可知，免疫后各组均呈上升趋势。免疫后7 d，Ⅸ、Ⅹ组显著高于Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05)；免疫后14，21 d，Ⅸ、Ⅹ组与Ⅶ、Ⅷ组差异极显著(P<0.01)，且Ⅹ组极显著高于Ⅸ组(P<0.01)；免疫后28 d，Ⅹ组极显著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组(P<0.01)，Ⅸ组显著高于Ⅶ、Ⅷ组(P<0.05)；第35 天，Ⅹ组高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组，差异极显著(P<0.01)，Ⅸ与Ⅶ组差异显著(P<0.05)，Ⅸ与Ⅷ组差异不显著(P>0.05)。结果表明,α-AL注射可提高鸡CD4+T细胞含量，以连续注射5次效果最好。

表3 α-AL对鸡血液中CD4+ T淋巴细胞亚群含量的变化

2.4.2CD8+T淋巴细胞亚群含量变化 由表4可知，各组均呈上升趋势。免疫后28 d，Ⅹ组显著高于对照组(P<0.05)，Ⅹ与Ⅸ组差异不显著(P>0.05)；其余时间点，试验组均高于对照组，Ⅹ组高于Ⅸ组，但差异不显著(P>0.05)。结果表明，α-AL注射有提高鸡CD8+T细胞含量趋势，连续注射5次组免疫后28 d效果最明显。

表4 α-AL对鸡血液中CD8+ T淋巴细胞亚群含量的变化

2.4.3CD4+/ CD8+T淋巴细胞亚群比值变化 由表5可知，免疫后7，14 d，各组差异均不显著(P>0.05)；免疫后21 d，Ⅹ组极显著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组(P<0.01)；免疫后28 d，Ⅹ组显著高于Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ组(P<0.05)；免疫后35 d，Ⅹ组极显著高于Ⅶ、Ⅷ组(P<0.01)，显著高于Ⅸ组(P<0.05)。结果表明，α-AL注射有提高鸡CD4+/CD8+T细胞亚群比值的作用，以连续注射5次的效果最好。

表5 α-AL对鸡血液中CD4+/ CD8+ T淋巴细胞亚群含量的变化

2.5 IL-2和IL-4 mRNA相对表达量变化经脾脏提取的RNA反转录为cDNA，上、下游引物为GAPDH扩增，预期产物长度为82 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳后，得到与预期相符的特异性条带(图5)。说明cDNA第1链符合要求。

M.DL2000 DNA Marker;1.GAPDH基因扩增结果

如图6所示，免疫后7 d，Ⅸ组IL-2 mRNA相对表达量显著低于Ⅷ组(P<0.01)；Ⅹ与Ⅷ、Ⅸ组差异不显著(P>0.05)。免疫后14 d，Ⅹ组极显著低于Ⅷ组(P<0.01)；Ⅸ与Ⅷ、Ⅹ组差异不显著(P>0.05)。免疫后21 d，Ⅸ组极显著高于Ⅷ、Ⅹ组(P<0.01)；Ⅹ与Ⅷ组差异不显著(P>0.05)。免疫后28 d，Ⅸ显著高于Ⅷ、Ⅹ组，Ⅹ组显著高于Ⅷ组，且差异极显著(P<0.01)。说明α-AL注射可提高鸡脾脏细胞IL-2的表达量，以连续注射3次最佳。

图6 IL-2 mRNA相对表达量变化结果

图7可知，免疫后7 d，Ⅸ、Ⅹ组IL-4 mRNA相对表达量显著高于Ⅷ组(P<0.01)；Ⅹ组显著高于Ⅸ组(P<0.05)。免疫后14 d，各组差异不显著(P>0.05)。首免后21 d，Ⅹ组显著低于Ⅷ组(P<0.05)；Ⅸ组表达量低于Ⅷ组，与Ⅷ、Ⅹ组差异不显著(P>0.05)。免疫后28 d，Ⅸ组极显著高于Ⅹ组(P<0.01)，与Ⅷ组差异不显著(P>0.05)；Ⅹ组表达量与Ⅷ组差异不显著(P>0.05)。结果说明，α-AL注射后7 d有上调IL-4 mRNA效果，但以后呈现下调表达趋势。

图7 IL-4 mRNA相对表达量变化结果

3 讨论

3.1 α-AL对鸡ND疫苗抗体效价的影响体液免疫是动物机体抵挡外界病原体侵入的重要因素之一，而抗体效价是权衡机体体液免疫功能的最直接指标之一。本研究各试验组抗体水平均高于对照组，其中Ⅳ组(20 mg/kg组)在免疫后7，21 d，与Ⅱ组(疫苗对照组)差异显著(P<0.05)，表明α-AL能提高鸡ND抗体水平，这与相关报道一致[9，15-18]。

3.2 α-AL对鸡免疫器官指数的影响动物机体免疫状态直接受免疫器官的发育状态、机能强弱影响，免疫器官指数是衡量免疫器官发育水平的一个基本指标，免疫器官指数与免疫器官发育水平呈正相关。已有的资料显示，当归运用于肉鸡、小鼠，对其免疫器官指数有显著提高作用[9]。本试验结果，α-AL注射对鸡胸腺、法氏囊和脾脏指数均呈正向作用，其中以20 mg/kg对鸡法氏囊指数效果最好。与前人相关报道基本一致。

3.3 α-AL对脾脏T、B淋巴细胞的影响T、 B淋巴细胞分别调节动物机体的细胞免疫和体液免疫，是构成动物机体免疫系统的重要细胞群体。淋巴细胞转化率是评价细胞免疫的一个重要指标。本试验用α-AL注射鸡只可使其T、B淋巴细胞刺激指数高于疫苗组鸡，说明α-AL能促进淋巴细胞增殖，使鸡的细胞免疫增强，这与龙锐、冯景奇等[9-11]报道的一致。

3.4 α-AL对T淋巴细胞亚群的影响CD4+、CD8+是T淋巴细胞重要的2个细胞亚群，也是机体免疫调节的枢纽。CD4+/CD8+比值在正常范围时，表明机体处于高免疫状态，若比例失调或缺陷，各种免疫疾病极易发生。本试验结果表明，注射α-AL组CD4+及CD4+/CD8+的值显著高于单纯疫苗组，说明α-AL能提高T淋巴细胞亚群活性，这与邱妍[19]和李淑芳等[20]报道的一致。

3.5 α-AL对细胞因子mRNA表达量的影响细胞因子具有调节适应性免疫和固有免疫等作用，其动态变化及含量可反映机体免疫功能状态。鸡细胞因子主要由Th细胞分泌，IL-2和IL-4分别属于Th1、Th2细胞因子，IL-2主要由Th1型CD4+T淋巴细胞分泌，可诱导多种免疫细胞增殖、分化、抗体分泌，以及诱生多种细胞因子，主要参与细胞免疫[21-23]；Th2细胞能辅助B淋巴细胞分化为分泌抗体的细胞，参与体液免疫。试验结果显示，α-AL能上调IL-2 mRNA表达水平，以连续注射3 d效果最佳，但对IL-4 mRNA表达呈现下调趋势，故α-AL主要表现为Th1型免疫。张宇晖[24]报道，α-AL作用于小鼠，对IL-2的分泌有显著促进作用，在高浓度时才对IL-4有显著抑制作用。本试验选择α-AL最佳给药浓度，对IL-2、IL-4结果与张宇晖[24]报道的基本一致。