插入BC株V蛋白的重组新城疫病毒(LaSota株)毒力鉴定及对先天性免疫的影响

于 桐，南福龙，王 政，于成东，孟 媛，李亭玉，蔡锦顺，鲁会军，金宁一

(1.延边大学 农学院，吉林 延吉133002；2.军事科学院 军事医学研究院 军事兽医研究所，吉林 长春130122；3.吉林大学 动物医学院，吉林 长春 130062)

新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的急性高度接触性动物传染病，自1926年发现以来，在全球有过4次大流行，给世界家禽养殖业造成巨大经济损失[1-3]。NDV是副黏病毒科(Paramyxoviridae)禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的有囊膜的单链负股、不分节段的RNA病毒[4]，具有多种基因型和唯一的血清型，血清型可再进一步分为Ⅰ和Ⅱ类[2]。从1946年我国首次分离到NDV F48强毒株至今，我国流行的毒株已经由Ⅸ型转变为Ⅶ型[5-6]，由于危害广泛,其致病和免疫机理成为研究的重点[7]。

基因Ⅱ型中等毒力NDV Beaudette C(BC)株长度为15 186 nt，NDV的P基因可通过RNA编辑机制在转录产物484位点(UUUUUCCC)插入1或2个非模板G，从而编码非结构蛋白V和W[8]。NDV的V蛋白能够拮抗宿主细胞IFN系统抑制IFN-β的生成，在病毒免疫逃避机制中起着至关重要的作用，但W蛋白功能目前尚不清楚[9]。Janus激酶/信号转导与转录激活子(the janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions,JAK/STAT)通路是重要的先天性免疫的信号通路，能够调节机体免疫系统，磷酸化 STAT1 是该信号传导通路上的关键蛋白，而模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)是宿主细胞抵抗病毒感染的重要防线，黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA5)是胞浆内的核酸受体，能与病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)相结合,特异性地识别双链 RNA，通过自身级联激活和招募结构域，从而激活转录因子，活化后的转录因子会进入细胞核，促进 IFN 的表达[10]，因此检测 P-STAT1 和 MDA5 的表达水平对探讨外源V蛋白对先天性免疫反应的影响有重要意义。

本试验为研究NDV中等毒力BC株V蛋白在感染过程中对毒力的提升和对先天性免疫及IFN拮抗作用的影响，测定了其鸡胚平均死亡时间(mean death time,MDT)、脑内致病指数(intracerebral pathogenicity index,ICPI)和静脉内致病指数(intravenous pathogenicity index,IVPI) 和重组病毒的毒力以及不同时间的感染效率，还检测了上清IFN-β生成情况，病毒感染12，24 h后P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平，及对DF1和A549细胞先天性免疫分子转录水平的影响，为进一步探索NDV V蛋白对先天性免疫及IFN拮抗机制的影响奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料ND重组病毒 rL-BC 株由军事兽医研究所分子病毒学与免疫学实验室保存；重组NDV弱毒 LaSota 亲本株由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所重要人兽共患病与烈性外来病实验室保存；9～11日龄SPF鸡胚、1日龄的SPF雏鸡、6周龄SPF鸡均购于哈尔滨兽医研究所实验动物管理中心。

1.2 病毒的毒力测定按照 OIE 标准公式测定MDT、ICPI和IVPI：稀释重组病毒和亲本毒并接种 SPF 鸡胚，观察鸡胚的死亡情况并计算MDT；并在10只1日龄的SPF 雏鸡体内接种稀释的重组病毒，计算 ICPI；之后静脉接种10只6周龄SPF鸡，观察鸡的发病死亡情况并计算IVPI。

1.3 病毒不同时间的感染效率测定亲本毒rL和重组病毒rL-BC感染DF1细胞4，8，12 h后，通过间接免疫荧光反应，检测其不同时间的感染效率。

1.4 病毒感染后IFN-β生成量测定亲本毒rL和重组病毒rL-BC感染DF1细胞后，分别收取4，8，12，24 h的细胞上清液，利用ELISA检测试剂盒检测IFN-β的生成量。

1.5 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平亲本毒rL和重组病毒rL-BC 感染后，利用Western blot检测IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平。

1.6 病毒 mRNA水平的测定重组病毒感染A549和DF-1细胞后提取RNA反转录，并进行荧光定量PCR，检测感染后多种PRRs和IFN下游分子的mRNA转录水平。

1.7 统计学分析通过GraphPad Prism 7.0软件对结果进行方差分析(ANOVA)，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒的毒力测定按照OIE标准测定MDT、ICPI、IVPI，结果显示，亲本毒和重组病毒的MDT均>90 h；测定ICPI时接种重组病毒的鸡死亡2只(表1),表明中等毒力BC株V蛋白的插入能提升LaSota株的毒力，但与亲本毒相比差别不大，仍属于弱毒水平。

表1 重组病毒的生物学特性

2.2 病毒不同时间的感染效率测定亲本毒rL和重组病毒rL-BC感染DF1细胞 4，8，12 h后其感染效率如图1所示。通过观察荧光发现，亲本毒感染细胞的能力有限，只会感染少量的细胞，而重组病毒感染细胞的数量要多于亲本毒，且12 h后已经能感染大部分的细胞。表明在病毒感染过程中，V蛋白的表达能增加弱毒LaSota株的感染效率。

A.4 h rL；B.4 h rL-BC；C.8 h rL；D.8 h rL-BC；E.12 h rL；F.12 h rL-BC

2.3 病毒感染后IFN-β的生成亲本毒rL和重组病毒rL-BC感染DF1细胞4，8，12，24 h后上清IFN-β的生成量如图2所示。感染后8～24 h亲本毒高于重组病毒，12 h时更是有显著性差异(P<0.001)，这说明V蛋白的插入会抑制IFN-β的生成，从而降低抗病毒效应。

图2 病毒感染后上清液IFN-β的生成水平

2.4 病毒感染后P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平亲本毒rL和重组病毒rL-BC感染后IFN上游P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平如图3所示。结果显示，插入外源V蛋白的重组病毒其P-STAT1和MDA5蛋白的表达量低于亲本毒，说明重组病毒对这2种蛋白的拮抗作用更强。

M.蛋白质相对分子质量Marker；1.PBS；2.rL；3.rL-BC

2.5 病毒感染后先天性免疫的转录水平变化荧光定量检测插入V蛋白的重组病毒rL-BC和亲本毒rL感染后对A549和DF1细胞先天性免疫的影响，结果显示，在A549细胞中，重组病毒与亲本毒相比，多种PRRs及IFN下游分子转录水平下降，其中IRF7和ISG15显著下降(P<0.05)(图4)；在DF1细胞中，重组病毒rL-BC比亲本毒rL感染所诱导的IFN-α、IRF7、LGP2和TLR3转录水平下降显著(P<0.05)(图5)。说明ND中等毒力BC株V蛋白插入后多种重要先天性免疫分子表达量降低，表明NDV的V蛋白能够抑制宿主对病毒感染后的先天性免疫反应。

图4 病毒感染A549细胞24 h后PRRs及IFN通路相关分子的转录水平

图5 病毒感染DF1细胞24 h后PRRs及IFN通路相关分子的转录水平

3 讨论

副黏病毒科是与黏液蛋白有特殊亲和性的一类病毒[11]，NDV作为副黏病毒科的一员，中等毒力毒株和高强毒力毒株会引起多种禽类的严重呼吸道疾病甚至死亡[12]。近些年，NDV的感染及致病宿主范围呈现不断扩大的趋势[13]。NDV V蛋白在影响病毒毒力、抑制IFN信号转导和宿主嗜性等方面起重要作用[14]。为探究BC中毒株V蛋白在病毒感染过程中对先天性免疫反应的影响，本研究测定了rL-BC的毒力和不同时间的感染效率，还检测了上清中IFN-β的含量以及P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平，最后检测了感染后DF1、A549细胞的先天性免疫分子的转录水平。感染后的Western blot和RT-PCR的检测结果显示BC株V蛋白插入后会降低P-STAT1和MDA5蛋白的表达以及多种PRRs如LGP2、TLR3和ISG15及IFN-α等IFN通路相关分子的转录水平。据报道，V蛋白对IFN的拮抗作用会影响病毒毒力[15]，V蛋白的缺失会引起病毒毒力的下降[16]，甚至无法在9日龄鸡胚中存活。本试验中V蛋白插入后重组病毒rL-BC的ICPI水平与亲本毒相比有提升，破坏细胞的能力也强于亲本毒，说明V蛋白插入提高了病毒毒力。NDV和另外几种副黏病毒的V蛋白可以通过E3泛素连接酶环指蛋白5(RNF5)靶向MAVS造成泛素化降解，而MAVS的降解会导致IFN-β生成通路被抑制，从而有利于病毒的增殖[17]，也能通过参与ERK介导的信号通路促进NDV的复制[3]。本试验中重组病毒上清的IFN-β生成量低于亲本毒也说明了V蛋白的插入会增强IFN的拮抗作用。另外，V蛋白还能与CacyBP/SIP相互作用[18]，靶向降解P-STAT1阻断IFN-α信号通路调节细胞凋亡和病毒复制[19]。P-STAT1和MDA5蛋白的表达水平下降，也证明V蛋白确实可通过抑制先天性免疫反应从而提高病毒毒力。

当病毒侵入宿主时，宿主会产生抗病毒免疫反应，其中IFN系统和PRRs及下游分子是宿主抵抗病毒感染的重要防线，在早期的天然免疫中发挥重要作用。近年来的研究结果发现NDV通过RNA编辑作用产生的V蛋白具有阻断IFN抗病毒活性的功能，因而和病毒的致病性有着密切关系[20-22]，所以对V蛋白进行研究对了解病毒致病机制有重要意义。本试验测定rL-BC毒力和其对先天性免疫的影响，为后续探究V蛋白在感染过程中对IFN和先天性免疫反应的拮抗作用的影响奠定基础。