藁本黄酮的纯化及体外抗氧化活性研究

韩秋菊，李薇，冯雅郡，王晨，陈仔君，潘睿悦，任璐，罗静雯

(辽宁石油化工大学 石油化工学院，辽宁 抚顺 113001)

藁本为伞形科植物藁本LigusticumsinenseOliv.或辽藁本LigusticumjeholenseNakaietKitag.的干燥根茎和根[1]，具有去湿除寒、缓解疼痛、抑菌抗炎、抗氧化、扩张血管、保护肝功能等功效，常用于医治风湿感冒、关节疼痛等疾病，是一种重要的中药材[2-4]。

大孔树脂具有污染低、稳定性高、选择性强、易操作等优点，常用于黄酮类化合物的分离纯化[5]。本文通过D-101大孔树脂柱层析对藁本黄酮粗提物进行纯化，并比较了纯化前后藁本黄酮的体外抗氧化活性，为更好地开发藁本资源、最大限度地利用其有效成分提供科学的理论依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

藁本，产自辽宁抚顺；芦丁标准品、DPPH均为色谱纯；硝酸铝、氢氧化钠、亚硝酸钠、过氧化氢、水杨酸、盐酸、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、无水乙醇、邻苯三酚、抗坏血酸均为分析纯。

ALC-1100.2型电子天平；Allbasic型分析研磨机；UV-2600型紫外可见分光光度计；HH-4型数显恒温水浴锅；DUG-9021A型电热恒温干燥箱；T0Z5-WS型离心机；LGJ-10型冷冻干燥机；RE-52AA型旋转蒸发器；SHB-Ш型循环水式多用真空泵。

1.2 实验方法

1.2.1 藁本黄酮的提取 取烘干的藁本样品，粉碎后过60目筛，以液料比15∶1加入75%的乙醇浸泡，超声(200 W，40 ℃，15 min)，水浴(50 ℃，2 h)，离心(3 000 r/min，5 min)，取上清液，55 ℃浓缩，冷冻干燥，得藁本黄酮粗提物。准确称取藁本黄酮粗提物，溶于70%乙醇中制备藁本黄酮粗提液。

1.2.2 藁本黄酮含量的测定 黄酮含量按照NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定[6]。芦丁标准曲线的线性回归方程为y=0.290 2x-0.005 1，

R2=0.999 8。

1.2.3 藁本黄酮的纯化

1.2.3.1 D-101大孔树脂的预处理 将D-101大孔树脂放入烧杯中，用95%乙醇浸泡12 h，充分溶胀后，滤除悬浮物，用95%乙醇反复冲洗，至加水不产生浑浊为止，用蒸馏水冲洗至无醇味，备用。

1.2.3.2 静态吸附与解吸实验 准确称取2.0 g预处理过的D-101大孔树脂，用滤纸吸干其表面水分，装入具塞磨口三角瓶中。加入藁本黄酮粗提液30 mL，于25 ℃、100 r/min 恒温振荡24 h，使其充分吸附，过滤，测定滤液中黄酮浓度，计算吸附率(%)，考察上样液黄酮浓度和pH值对D-101大孔树脂吸附藁本黄酮性能的影响。将过滤后的树脂装入具塞磨口三角瓶中，再加入30 mL乙醇溶液，于25 ℃、100 r/min 恒温振荡24 h，使其充分解吸，过滤，测定滤液中的黄酮浓度，计算解吸率(%)，考察洗脱液浓度对D-101大孔树脂解吸性能的影响。

吸附率=(C0-C1)/C0×100%

解吸率=(C2×V2)/[(C0-C1)×V0]×100%

式中C0——吸附前上样液黄酮浓度，mg/mL；

C1——吸附后滤液中黄酮浓度，mg/mL；

C2——解吸液中黄酮浓度，mg/mL；

V0——上样液体积，mL；

V2——解吸液体积，mL。

1.2.3.3 动态吸附与解吸实验 将预处理过的D-101大孔树脂装入规格为2.6 cm×50.0 cm 的玻璃层析柱中，藁本黄酮上样液按一定流速上样，测定流出液中黄酮的浓度，计算吸附率，考察上样液体积和流速对D-101大孔树脂吸附藁本黄酮性能的影响。用3 BV的水淋洗树脂柱，之后洗脱液按一定流速解吸，测定流出液中的黄酮浓度，计算解吸率，考察洗脱液流速对D-101大孔树脂解吸性能的影响及洗脱液用量。

1.2.3.4 藁本黄酮纯化工艺验证实验 按照优化后的条件纯化藁本黄酮，收集洗脱液，55 ℃浓缩，冷冻干燥。准确称取固体样品，溶于70%乙醇中，计算藁本黄酮回收率(%)和纯度(%)。

回收率=吸附率×解吸率×100%

纯度=C×V/M×100%

式中C——藁本黄酮浓度，mg/mL；

V——藁本黄酮溶液体积，mL；

M——藁本黄酮固体样品质量，mg。

1.2.4 藁本黄酮体外抗氧化实验

1.2.4.1 清除DPPH自由基 取 0.2 mmol/L DPPH 溶液2 mL，加入1 mL不同浓度的藁本黄酮样品或VC溶液、1 mL 95%乙醇，混匀，室温暗光下反应30 min，以重蒸水作参比，于517 nm测定样品吸光值，以95%乙醇为空白对照[7]，计算清除率(%)。

清除率=(AC-AS)/AC×100%

式中AC——空白组吸光度；

AS——样品组吸光度。

以下清除率计算均用此式。

1.2.4.3 清除羟基自由基(·OH) 取10 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，加入1 mL 10 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、1 mL不同浓度的藁本黄酮样品或VC溶液、1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，水浴(37 ℃，30 min)，以重蒸水作参比，于510 nm测定样品吸光值，计算清除率[9]。

2 结果与讨论

2.1 藁本黄酮纯化工艺条件研究

2.1.1 上样液pH的影响 将藁本黄酮粗提液按图1条件调节为不同pH值的上样液，进行静态吸附实验，上样液浓度为2.0 mg/mL，结果见图1。

图1 上样液pH值对吸附率的影响Fig.1 Effect of pH value of loading solution on adsorption rate

由图1可知，pH值对吸附率的影响较大，pH值为4左右时，吸附率达到最大值，随着pH值的进一步增大，吸附率呈下降趋势，故选择上样液pH值为4。

2.1.2 上样液浓度的影响 将藁本黄酮粗提液按图2条件稀释为不同浓度的上样液，进行静态吸附实验，上样液pH为4，结果见图2。

图2 上样液浓度对吸附率的影响Fig.2 Effect of loading solution concentration on adsorption rate

由图2可知，在上样液浓度>2.5 mg/mL后，吸附率明显下降，故上样液浓度选择2.5 mg/mL。

2.1.3 上样液体积的影响 将浓度为2.5 mg/mL、pH 4的藁本黄酮上样液以2 mL/min 流速上样，按柱体积倍数分段收集流出液，测量流出液中黄酮浓度，结果见图3。

图3 上样液体积的影响Fig.3 Effect of loading solution volume

由图3可知，当上样量增加到0.5 BV 时，流出液中开始出现藁本黄酮，当上样液到2.5 BV时，测定流出液黄酮浓度为0.24 mg/mL，接近于上样液浓度的10%，此时即为曲线的泄露点，故上样液体积选择2.5 BV。

2.1.4 上样液流速的影响 分别取7组2.5 BV浓度为2.5 mg/mL、pH 4的上样液，以不同上样流速上样，进行动态吸附实验，结果见图4。

由图4可知，吸附率随上样液流速增加而减小，流速>3 mL/min后，吸附率下降明显，吸附不完全，故上样液流速选择3 mL/min。

图4 上样液流速对吸附率的影响Fig.4 Effect of loading liquid velocity on adsorption rate

2.1.5 洗脱液浓度的影响 分别以不同浓度的乙醇溶液作为洗脱液进行静态解吸实验，结果见图5。

图5 洗脱液浓度对解吸率的影响Fig.5 Effect of eluent concentration on desorption rate

由图5可知，随洗脱液浓度的增加，藁本黄酮的解吸率逐渐增大，当洗脱液的浓度为70%时，解吸率达到最大值，故洗脱液浓度选择70%。

2.1.6 洗脱液流速的影响 将 2.5 BV 浓度为 2.5 mg/mL、pH 4的上样液按3 mL/min 的流速上样，3 BV水淋洗层析柱，用70%乙醇分别按不同流速进行动态解吸实验，结果见图6。

图6 洗脱液流速对解吸率的影响Fig.6 Effect of eluent flow rate on adsorption rate

由图6可知，随洗脱液流速的增加，藁本黄酮的解吸率先略升高，当洗脱液流速为 2 mL/min 时，曲线具有最高点，继续增加洗脱液流速，解吸率下降明显，故洗脱液流速选择2 mL/min。

2.1.7 洗脱液体积的影响 将2.5 BV浓度 2.5 mg/mL、pH 4的上样液按3 mL/min 的流速上样，3 BV水淋洗层析柱，用70%乙醇以3 mL/min流速洗脱，按柱床体积对解吸液进行分段收集，测量解吸液中的黄酮浓度，结果见图7。

图7 洗脱液体积的影响Fig.7 Effect of eluent volume

由图7可知，洗脱液用量为 5 BV 时，吸附的黄酮基本被解吸完全，故洗脱液用量5 BV左右为宜。

2.1.8 纯化工艺验证 按照上述实验得到的最佳纯化工艺条件对藁本黄酮粗提液进行纯化，藁本黄酮的回收率达到81.88%，纯化后样品纯度达到71.09%，比纯化前纯度(34.76%)高出2.05倍，说明此纯化工艺效果较好。

2.2 藁本黄酮纯化前后体外抗氧化活性研究

2.2.1 对DPPH自由基清除率的测定 由图8可知，VC和粗提、纯化藁本黄酮对DPPH自由基的清除率均随样品浓度的增加呈上升趋势，清除DPPH自由基的IC50值分别为140.2，862.1，386.8 μg/mL，纯化后藁本黄酮清除DPPH自由基的能力增强，略低于VC，但明显高于粗提藁本黄酮。

图8 藁本黄酮对DPPH自由基的清除能力Fig.8 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on DPPH free radical

图9 藁本黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.9 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on superoxide anion radical

2.2.3 对羟基自由基(·OH)清除率的测定 由图10可知，VC和粗提、纯化藁本黄酮对·OH的清除率均随样品浓度的增加呈上升趋势，清除·OH的IC50值分别为348.4，1 689.4，953.3 μg/mL，纯化后藁本黄酮清除·OH的能力增强，虽明显低于VC，但高于粗提藁本黄酮。

图10 藁本黄酮对羟基自由基的清除能力Fig.10 Scavenging ability of Ligusticum flavonoids on hydroxyl radical

3 结论

采用D-101大孔树脂对藁本黄酮粗提液进行纯化的最佳工艺为：将体积为2.5 BV、浓度2.5 mg/mL、pH 4的上样液以3 mL/min流速上样后，用体积5 BV、浓度 70%的乙醇溶液以2 mL/min流速洗脱，此条件下藁本黄酮回收率可达81.88%，样品纯度达到71.09%。

纯化前后的藁本黄酮均具有一定的体外抗氧化活性。纯化后藁本黄酮的抗氧化活性明显增强，其清除DHHP自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基的IC50值分别为386.8，764.0，953.3 μg/mL。