Gd-IgA1在过敏性紫癜大鼠模型发病中的机制研究※

张晓强,李孟芳,刘品莉

(1.山西省中医院,山西 太原 030012;2.山西省太原市迎泽区郝庄中心卫生院,山西 太原 030025)

过敏性紫癜又称亨诺-许兰紫癜(henoch-schonlein purpura,HSP),是一种常见的自身免疫参与的血管炎性疾病,临床表现为皮肤紫癜、关节痛、腹痛及肾脏损害等[1]。过敏性紫癜性肾炎(henoch-schonlein purpura nephritis,HSPN)是其较严重的后遗症[2]。本课题组前期采用中西医结合方法建立了HSP大鼠模型[3]。近年有学者提出糖基化缺陷Ig A1(Gd-Ig A1)与HSP发病有关,而在HSP的病因中感染占第1位。基于此,笔者对Gd-Ig A1在HSP大鼠模型发病中的可能机制进行了实验研究。

1 实验方法

1.1 材料与方法

(1)动物与分组 选取健康SD大鼠60只,清洁级,体质量(180±20)g,6周龄,雌雄各半,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司动物室供应[使用许可证:SCXK(湘)2019-0004,质量合格证:1100111911008834],饲养于云南一同实验教育科技有限公司中心实验室动物房。适应喂养1周后将大鼠按随机数字表法分为对照组和GABHS感染组,每组30只,依据分组不同分别饲养于具有独立通气的消毒饲养箱内,室温恒定,过滤空气,湿度50%～65%,光照10～12 h/d,自由摄取特殊饲料(标准饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司有限公司提供,在标准饲料中加入小麦、花生、奶粉、鸡蛋、黄豆、虾、带鱼、榛子等混合粉)及纯净水(由深圳宏博水处理设备有限公司生产的HBⅡ-C型纯水机制备)。注:链球菌属于第4类病原微生物,通常情况下不会引起人类或动物疾病。

(2)主要试剂和药物 胡椒、干姜、荜茇中药配方颗粒剂(批号分别为1908098、1911058、1907020,江阴天江药业有限公司);A组β型溶血性链球菌(GABHS)标准菌株(批号BNCC338425,苏州北纳创联生物技术有限公司);大鼠Gd-Ig A1酶联免疫分析试剂盒(货号:ml059544-1,上海酶联生物科技有限公司);大鼠C-反应蛋白(CRP)检测试剂盒(货号:ml002010-1,上海酶联生物科技有限公司);ASO检测试剂盒(多种属)(货号:ml059905-1,上海酶联生物科技有限公司);Anti-Gd-Ig A1免疫组化试剂盒(货号:ab212330,Abcam);苏木素伊红(HE)染色试剂盒(货号:G1120,Solarbio);山羊血清(货号:S9070,Solarbio);DAB显色试剂盒(20x)(货号:DA1010,Solarbio);其他常规试剂由云南一同实验教育科技有限公司中心实验室提供。

1.2 模型建立及方法

(1)血热证动物模型建立 GABHS感染组大鼠采用热性药物灌胃建立血热证动物模型,热性药物浓度为0.15 g/m L(现用现配,每次灌胃稀释至2 m L),每日2次。对照组给予等量的0.9%氯化钠注射液灌胃,自由饮食,不做其他处理。共灌胃3周。注:热性药物成人(按60 kg计)每日处方量为干姜5 g,荜茇5 g,胡椒5 g;动物给药量的换算公式为dB＝d A×KB/KA,dB为大鼠每日每kg灌药量,d A为成人每日每kg用药量,KB＝0.71,KA＝0.11,为常数。

(2)GABHS感染及过敏(炎性)反应实验 血热证模型建立后,应用在TSB液体培养基恒温环境中培养好的GABHS菌株液,待其生长至对数生长期,3 500 r/min离心10 min,PBS液洗涤2次,调节细菌浓度为1010CFU,保存在4℃冰箱中。血热证模型大鼠连续5 d经口、鼻腔滴注GABHS菌株液,0.5 m L/只,观察14 d。造模的最后3 d,再次应用上述方法激发过敏(炎性)反应。

1.3 模型观察与指标检测

(1)一般状况 在造模前后观察大鼠一般状况,包括体温、精神状况、进食进水量、毛被、活动量、舌苔、口唇、结膜、耳郭、粪便颜色和硬软度、尿的颜色和气味等。

(2)指标和观察病理变化 ①尿红细胞计数。造模后两组大鼠收取12 h尿液,静置片刻,分别取5 m L放入尿液检查塑料管中,采用全自动尿沉渣分析仪测定尿红细胞计数。②血细胞分析、血清免疫相关指标(ASO、CRP)及Gd-Ig A1指标。两组随机取20只大鼠,分别于造模前后晨起空腹抽取下腔静脉血约3 m L,置EDTA抗凝管中,1 h内取20μL,用兽用全自动血细胞分析仪检测血细胞计数;其余血液在室温下放置2 h后,4 000 r/min离心15 min,取血清400μL,分装于3个EP管中,置入－70℃冰箱保存备用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清ASO、CRP及Gd-Ig Al水平,操作步骤按照试剂盒说明书进行。③皮肤、肾脏病理检查。造模后两组随机选取20只大鼠,摘取左右后肢皮肤及双侧肾脏,用10%中性福尔马林溶液固定24 h,梯度乙醇(70%、80%、90%、95%、无水乙醇)脱水,二甲苯透明,石蜡包埋切片,厚度为3μm,分别进行HE染色和免疫组化染色,并在光镜下观察并拍片。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料符合正态分布时采用均数±标准差(±s)表示,组内比较采用配对样本t检验,组间比较采用独立样本t检验;指标之间相关性采用Pearson相关分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 对照组大鼠精神、摄食均较正常。GABHS感染组大鼠造模后出现不同程度喜饮、烦躁、呼吸频率增高、搔抓、口唇发干、耳郭赤红、眼结膜充血、粪便干燥、小便发黄、偶见鼻衄等现象,4只大鼠在实验期间有皮肤紫癜出现。

2.2 尿红细胞计数 对照组大鼠在实验过程均未出现明显尿红细胞升高。GABHS感染组大鼠造模后尿红细胞较造模前明显升高,且高于对照组(P＜0.01)。见表1。

表1 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后尿红细胞计数比较(个/m L,±s)

表1 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后尿红细胞计数比较(个/m L,±s)

注:1.GABHS,A组β型溶血性链球菌。2.与本组造模前比较,△P＜0.01;与对照组造模后比较,▲P＜0.01。

组别 只数 造模前 造模后GABHS感染组 30 4.47±2.22 26.73±9.67△▲对照组 30 4.17±1.76 3.50±1.80

2.3 血液检查

(1)血细胞分析 对照组大鼠在实验过程均未出现明显白细胞计数、N计数升高。造模后,GABHS感染组大鼠白细胞、N计数较造模前及对照组造模后显著升高(P＜0.01)。见表2。

表2 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后血白细胞计数、中性粒细胞计数比较(±s)

表2 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后血白细胞计数、中性粒细胞计数比较(±s)

注:1.GABHS,A组β型溶血性链球菌。2.与本组造模前比较,△P＜0.01;与对照组造模后比较,▲P＜0.01。

组别 只数白细胞计数(×109/L)中性粒细胞(×109/L)造模前 造模后 造模前 造模后GABHS感染组 20 4.71±0.57 12.81±3.26△▲ 0.46±0.08 0.79±0.06△▲对照组 20 4.92±0.70 4.76±0.64 0.46±0.09 0.46±0.08

(2)血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平 对照组大鼠在实验过程均未出现明显血ASO、CRP、Gd-Ig A1升高。GABHS感染组大鼠造模前血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平基本处于正常范围,造模后血ASO、CRP、Gd-Ig A水平明显升高。造模后,GABHS感染组大鼠血ASO、CRP、Gd-Ig A1水平较造模前及对照组造模后显著增高(P＜0.01)。见表3。

表3 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后抗链球菌溶血素O、C-反应蛋白及糖基化缺陷IgA1水平比较(±s)

表3 对照组与GABHS感染组大鼠造模前后抗链球菌溶血素O、C-反应蛋白及糖基化缺陷IgA1水平比较(±s)

注:1.ASO,抗链球菌溶血素O;CRP,C-反应蛋白;Gd-Ig Al,糖基化缺陷Ig A1;GABHS,A组β型溶血性链球菌。2.与本组造模前比较,△P＜0.01;与对照组造模后比较,▲P＜0.01。

组别 只数 ASO(IU/m L)CRP(μg/m L)Gd-Ig A1(μg/m L)造模前 造模后 造模前 造模后 造模前 造模后GABHS感染组 20 51.95±25.11 204.20±135.15△▲ 1.73±1.43 43.58±26.70△▲ 4.25±1.01 18.43±5.26△▲对照组 20 51.00±33.21 60.50±34.24 2.07±1.43 1.51±1.23 3.56±1.59 4.21±2.06

2.4 指标相关性分析 经Pearson相关分析后,血白细胞计数与血Gd-Ig A1水平呈正相关(r＝0.61,P＜0.01),血ASO与Gd-IgA1水平呈正相关(r＝0.46,P＜0.05)。

2.5 皮肤、肾脏病理检查

(1)大鼠后肢皮肤HE染色及免疫组化 大鼠后肢皮肤切片HE染色比较:对照组皮肤组织光镜下观察可见表皮、真皮与皮下组织分界清晰,未见明显病理变化(图1见本期第125页);GABHS感染组皮肤组织光镜下观察可见真皮层小血管扩张,内皮细胞肿胀,红细胞渗出至血管外组织,血管周围有较多的中性粒细胞浸润(图2见本期第125页),可见GABHS感染组皮肤存在炎性反应。大鼠后肢皮肤切片Gd-Ig A1免疫组化比较:对照组皮肤组织无Gd-Ig A1的表达(图3见本期第125页);GABHS感染组皮肤组织偶可见轻微棕黄色的Gd-Ig A1的表达(图4见本期第125页)。

图1 对照组大鼠后肢皮肤HE染色(×200)

图2 GABHS感染组大鼠后 肢皮肤HE染色(×200)

图3 对照组大鼠后肢皮肤Gd-IgA1免疫组化(×200)

图4 GABHS感染组大鼠后肢 皮肤Gd-IgA1免疫组化(×200)

(2)大鼠肾脏HE染色及免疫组化 大鼠肾脏HE染色比较:对照组肾组织结构基本正常,未见明显病理变化(图5见本期第125页);GABHS感染组大鼠肾小球内分叶不明显,系膜区略增宽,呈弥漫的轻中度的系膜细胞数量增多和基质增生,肾小球毛细血管内红细胞瘀滞,系膜区和间质区有单核细胞和中性粒细胞浸润(图6见本期第125页)。大鼠肾脏Gd-Ig A1免疫组化比较:对照组肾小球系膜区未见明显Gd-Ig A1的表达(图7见本期第125页);GABHS感染组肾小球系膜区有较强的呈棕黄色团块状或颗粒状的Gd-Ig A1的表达,或围绕血管壁呈环状沉积(图8见本期第125页)。

图5 对照组大鼠肾脏HE染色(×200)

图6 GABHS感染组大鼠 肾脏HE染色(×200)

图7 对照组大鼠肾脏Gd-IgA1免疫组化(×200)

图8 GABHS感染组大鼠肾脏Gd-IgA1肾脏免疫组化(×200)

3 讨论

HSP的发病与感染、食物、环境污染、药物、疫苗等导致的免疫损伤有关,其中感染占第1位[4]。A族链球菌(GAS)特别是GABHS的感染与HSP发病关系密切[5-6],约1/4的HSP患儿肾小球系膜有GABHS抗原沉积[7]。经抗感染治疗后,HSP的复发率显著降低[8]。

GAS是链球菌中致病性较强的一种,当人或动物感染GAS后,其菌体及内部结构、代谢产物可刺激B淋巴细胞(BC)产生大量ASO。M蛋白(MP)是GAS的主要致病因子,含MP的链球菌具有抵抗吞噬的作用。MP与心肌、肾小球基底膜有共同的抗原,可刺激机体产生特异性抗体。GAS可分泌多种胞外酶,这些酶能与淋巴细胞受体的特定区域结合,导致淋巴细胞增殖;还能与很多血浆蛋白结合,诱导交叉免疫反应;还可破坏吞噬细胞,刺激多形核白细胞黏附于内皮细胞,阻止粒细胞移入,导致血管损伤[1]。本研究发现HSP大鼠造模前ASO水平基本处于正常范围,造模后ASO水平明显升高。考虑与GABHS感染后,其菌体及内部结构、M蛋白片段作为抗原和其释放的多种胞外酶结合或刺激BC产生大量ASO及相关抗体,并产生级联免疫炎性反应,从而损伤内皮细胞,进而造成血管炎。

CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白。CRP通过与配体(如入侵细菌的磷酰胆碱)结合,激活补体和单核吞噬细胞系统导致炎性反应。本研究发现大鼠造模前CRP水平基本处于正常范围,GABHS感染造模后CRP水平明显升高,考虑GABHS感染后,CRP可能与GABHS的磷酰胆碱结合激活补体,进而造成免疫炎症。

HSP的病理是由Ig A介导的,尤其是以Ig A1为主的自身抗体形成和大量Ig A1免疫复合物(IC)沉积于血管壁造成的小血管炎[9],Ig A1对HSP的发生、发展具有重要的作用[10]。Ig A1一部分是由呼吸道黏膜组织合成,而HSP与呼吸道感染有关[11]。本研究发现GABHS感染组肾小球系膜区有较强的Gd-Ig A1的表达,考虑与GABHS感染后,呼吸道黏膜产生大量的Ig A1相关。

正常情况下Ig A1分子可以正常糖基化,其N-乙酰半乳糖胺(Gal NAc)在N-乙酰半乳糖胺转移酶(Gal NAc T2)的催化下,与Ig A1分子铰链区丝氨酸或苏氨酸的羟基相结合构成O-聚糖结构,然后在1,3-半乳糖基转移酶(C1Gal T1)的催化下,以1,3键将半乳糖连接至Gal NAc上。唾液酸在唾液酸转移酶的催化下,以2,3或2,6键与Gal NAc链接形成延长的糖链,并使O-聚糖带负电荷。然后通过与肝脏去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)结合而被清除。而一些原因所致的糖基化缺陷的Ig A1(Gd-Ig A1)由于O-聚糖链末端的半乳糖缺失,不能被肝细胞识别而被清除。研究发现,GAS表面含有GalNAc结构,这些结构可能模拟了Gd-Ig A1的多糖表位,刺激机体产生相应的抗体,与Gd-Ig A1或GABHS菌体本身交叉反应形成Ig A1-IgG-IC沉积于血管壁,导致免疫复合物性小血管炎,造成体内Gd-Ig A1蓄积,Ig A1-IgG-IC与HSPN的发病密切相关[12]。因此,GABHS感染为上述免疫复合物形成的始动因素[11]。研究证实,HSP血清及毛细血管袢、肾小球系膜区、消化道黏膜组织等沉积的Ig A1均为Gd-Ig A1[11],是引发肾脏免疫炎性反应的重要环节[13]。Ig A1分子的异常糖基化水平高低不同可导致自身抗原暴露程度的差异,决定了自身免疫反应强度[14]。本研究证实GABHS感染组血清Gd-Ig A1水平显著升高,皮肤及肾脏Gd-Ig A1免疫组化阳性表达,提示Gd-Ig A1参与了HSP发病。

本研究结果显示,血白细胞计数与血Gd-Ig A1、ASO与Gd-Ig A1水平呈正相关,可推测HSP的感染发病机制如下:①病原体感染机体后,其菌体及内部结构、代谢产物均可使机体产生免疫应答,炎性因子增多,机体处于BC活化状态。②病原体表面含有的Gal NAc结构可能模拟了Gd-Ig A1的多糖表位,刺激机体产生相应的抗体,与Gd-Ig A1或病原体本身交叉反应形成Ig A1-IgG-IC沉积于血管壁,导致免疫复合物性小血管炎。③上述免疫反应会释放炎性因子及过敏介质,累及多器官及系统,出现HSP多变的临床症状和并发症。

综上所述,Gd-Ig A1参与了HSP发病,感染为上述免疫炎症形成的始动因素。Gd-Ig A1可作为HSP发病一种重要标志,并可作为一种简便的临床检测指标。血清Gd-Ig A1滴度可随临床症状的加重(减轻)而升高(降低),而Gd-Ig A1肾脏免疫组化检测亦能对疑难病例进行确诊或病情评估。笔者认为,长期或反复的病原菌感染使机体处于BC活化状态是HSP发病的体质基础。临床上对于有感染征象的HSP患者,应常规进行相关病原体抗体检查或病原菌培养,针对性地应用抗生素治疗,可有效缩短HSP病程,降低复发率,减轻脏器损伤;缓解期主动预防病原菌感染,可对其过敏体质进行调治,实现“体质脱敏”及治未病。