新疆两个地方绵羊品种策勒黑羊、吐鲁番黑羊的基因组选择信号分析

王 琼，曹 行，张小洪，刘玲玲，马海玉，蒋芳芳，刘武军*

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆吐鲁番职业技术学院，新疆 吐鲁番 838000)

近年来，在绵羊遗传育种中，选择信号的检测成为鉴定影响重要经济性状潜在作用基因和决定表型变异相关功能基因的重大策略[1]。Moradi等[2]利用绵羊商业化的50K SNP芯片对伊朗两个脂尾和瘦尾不同尾型绵羊品种，采用Fst(Fixation index，群体分化指数)方法进行了群体间选择信号检测，结合单倍型分析结果在脂尾绵羊5号、7号和X染色体上发现了与脂肪沉积相关的基因组选择区域，而且在这些区段内鉴定到与脂肪代谢相关基因NPR2、PPP2CA。Kijas等[3]也利用Fst方法对74个品种的绵羊全基因组进行了选择信号检测，结果发现了控制羊毛色的基因ASIP与绵羊角型相关的基因RXFP2和与骨骼肌发育相关的基因BMP2。2015年Wang等[4]也利用绵羊商业化的50K SNP芯片对三个肉用绵羊品种[3]蒙古羊、德国美利奴羊、杜泊羊用di[4]方法对其全基因组进行了选择信号检测，结果发现了与绵羊肉质性状相关的基因ALDOA、STK32B和FAM190A，与繁殖性状相关的基因CCNB2和SLC8A3。Caiye等[5]用Fst和iHS(integrated haplotype score，综合单倍型评分)方法对三个肉用绵羊苏尼特羊、德国美利奴羊、杜泊羊X染色体进行了选择信号检测，结果在X染色体上发现了与繁殖性状相关的BMP15基因，与免疫相关的VSIG4和PCDH11X基因，与神经系统和皮肤相关的基因PCDH19。

新疆由于地域广阔、气候生态环境多样，在长期自然选择、人工选育过程中形成了丰富且各具特色的绵羊种质资源。在新疆地方绵羊品种中，策勒黑羊的繁殖性能突出，为短瘦尾；而吐鲁番黑羊盛产优质羔羊肉，为短脂尾，两个品种分别在繁殖力、脂肪沉积方面具有典型的代表性[6]。本研究以新疆地方绵羊品种策勒黑羊(羔皮型)与吐鲁番黑羊(肉脂兼用粗毛型)为试验对象，利用两种选择信号分析方法Fst、Pi(nucleotide diversity，核苷酸多态性)，挖掘和筛选繁殖及脂肪代谢相关候选基因，为我国绵羊的分子选育及品种资源保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

在新疆和田地区策勒县、吐鲁番市托克逊县，分别选取策勒黑羊、吐鲁番黑羊成年母羊各15只，颈静脉采集血样，枸橼酸钠抗凝，-20℃冰箱保存。

1.2 试验方法

1.2.1 全基因组重测序

从采集的血样中提取DNA，构建高通量测序双末端测序(PE，paired-end)文库，利用Illumina公司的Hiseq3000平台进行全基因组重测序，测序深度10×，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。利用PLINK软件对重测序原始数据进行质控处理，质控标准是：(1)SNP检出率＞90%；(2)最小等位基因频率＞0.01；(3)服从哈迪温伯格定律。

1.2.2 选择信号分析

利用vcftools，计算吐鲁番黑羊、策勒黑羊两个群体之间的Fst值，选取25 kb的滑动窗口，计算每个窗口所有标记的Fst值平均值，将其作为此窗口的Fst值；分别计算策勒黑羊、吐鲁番黑羊的Pi值，同样选取25 kb的滑动窗口，将每个窗口所有标记的Pi值平均值作为此窗口的Pi值。

1.2.3 候选基因检测和注释

取前1%窗口片段中的相同SNPs(single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性)位点作为候选位点，以候选位点为中心，上下游各延伸200 kb作为候选区域，参照NCBI数据库绵羊参考基因组(Ovis aries v3.1)，利用PLINK软件进行基因注释，将其定义为选择信号的“候选基因”。

1.2.4 候选基因富集分析

利用DAVID v6.7(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)数据库对候选基因进行GO(Gene Ontology)分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析，挖掘与绵羊繁殖性状、脂肪沉积等密切相关的功能基因。

2 结果与分析

2.1 重测序结果

两个品种30只绵羊重测序共产生253.93 G的原始测序数据，质控后获得252.43 G的处理后测序数据，含16 643 570个SNPs。测序质量评估值为Q20≥97.03%、Q30≥93.31%，GC含量在40.51%～42.63%之间，结果表明本次测序所获数据可靠，可用于后续分析。

2.2 选择信号分析结果

在Fst检测中，有128 252个SNPs位点高于阈值线，Fst的top1%阈值为0.455；在Pi检测中，有128 396个SNPs位点高于阈值线，Pi的top1%阈值为0.787，具体见图1。

图1 Fst（左）和Pi（右）在羊染色体上的分布图

2.3 两种方法联合分析结果

对Fst、Pi两种选择信号分析获得的top1%SNPs求交集，获得121 758个共有SNPs，可用于后续基因注释。

2.4 候选基因的注释

利用PLINK软件对两种方法121 758个共有SNPs(top1%)进行基因注释，共注释到63个候选基因，其中与绵羊繁殖及脂肪代谢相关候选基因如表1所示，注释出的15个繁殖性状候选基因，与性腺轴激素分泌、季节性发情、昼夜节律调节、胚胎发育、卵泡发育和排卵、公羊繁殖等相关；注释出的8个脂肪代谢候选基因，与肌细胞增殖分化、脂肪细胞分解等相关。

表1 选择信号区域重要性状候选基因

续表

2.5 功能富集分析

对Fst和Pi筛选出的所有280个候选基因进行GO分析和KEGG pathway分析，结果见表2、表3。由表可知，候选基因涉及精细胞发育、性腺发育、子宫内胚发育、骨骼系统发育、脂肪酸β氧化、视黄醇代谢、TGF-β信号通路、FoxO信号通路、PI3K-Akt信号通路、抗EGFR酪氨酸激酶抑制剂通路等。

表2 受选择基因GO分析

表3 受选择基因KEGGpathway分析

续表

3 讨 论

表型改变是对目标基因强烈定向选择的结果，而与选择相对应的基因组信息，就是“选择信号”[7]。策勒黑羊属羔皮型绵羊，全年发情和繁殖率高是其突出的品种特性，母羊两年三产较多，平均产羔率215%，成年公羊体重59.4±3.9 kg，属短瘦尾羊[6]。而吐鲁番黑羊属肉脂兼用粗毛型绵羊，季节性发情，产羔率仅100.6%，但羊肉品质好，氨基酸和蛋白质含量丰富，成年公羊体重61.7±10.5 kg，属短脂尾羊[7]。可以看出，在表型上，2个品种的繁殖性状及脂肪沉积性状存在较大差异。因此，本研究利用选择信号分析方法在2个绵羊品种中挖掘繁殖及脂肪代谢相关候选基因的方案是可行、科学的。

在本研究筛选的繁殖性状相关功能基因中，BCL2L11被证明参与小鼠胚胎干细胞凋亡过程，是miR-302a的靶基因[8]；DDRGK1主要表达于小鼠和山羊的子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞，并在子宫内膜炎症反应中表达上调[9]；AMH是检测人多囊卵巢综合征伴不孕症的重要血清指标之一[10]；UBE2B基因敲除小鼠的精原细胞减数分裂受抑制，精子活力下降，畸形精子数目增多，表现为雄性不育[11]。在筛选的脂肪代谢相关功能基因中，转录因子IRX3的突变导致人类和小鼠的骨骼模式缺陷，影响骨髓脂肪细胞的增殖[12]；HOXC10参与绵羊成脂、成骨分化的调控，影响肌内脂的生成[13]；PNPLA7受胰岛素及不饱和脂肪酸调控，参与小鼠脂肪细胞分化过程[14]等。以上研究一方面证实了本试验结果的可靠性，另一方面也挖掘出了一些只在小鼠、人中被证实，但在山羊、绵羊中极少见报道的功能基因，应重视此类基因可能对绵羊繁殖及产肉性能的调控作用，进一步探究和验证。

在本研究候选基因参与的信号通路中，视黄醇信号通路中，视黄醇及其衍生物对于动物卵巢类固醇激素的合成是必不可少的[15]。研究发现，大鼠卵巢颗粒细胞中的视黄醇可以抑制卵泡刺激素的表达并促进促黄体生成素的表达[16]，从而影响其繁殖性能。cAMP信号通路中，环磷酸腺苷-蛋白激酶A(cAMP-PKA)调控增加细胞内cAMP含量进而导致PKA被激活，导致精子中相关蛋白磷酸化，进而调节精子获能、超活化、趋化性和顶体反应等多种生理过程[17]，从而使家畜的繁殖力收到影响。TGF-β信号通路已被许多研究证实，其家族成员参与卵巢功能的调节和卵巢卵泡的发育，如BMP15、FecB、GDF9等。PI3K/Akt信号通路被认为是最重要的细胞内通路之一，它在癌症、细胞增殖、胚胎干细胞和胚胎发生等生命过程中起着重要作用。近年来，越来越多的报道证实了PI3K/Akt和一些下游效应分子组成的信号通路在卵泡形成、生长、排卵和黄体化过程中发生变化，提示PI3K/Akt信号通路对卵巢卵泡发育有重要作用[18]。也有研究发现，PI3K/Akt信号通路可以调节卵母细胞减数分裂事件，影响卵母细胞成熟能力，表明PI3K/Akt信号通路参与调控卵母细胞的成熟[19]，从而影响家畜的繁殖能力。

4 结论

本研究利用策勒黑羊和吐鲁番黑羊全基因组重测序数据，应用Fst和Pi方法进行绵羊基因组选择信号检测，经基因注释和功能富集，最终筛选出23个与绵羊繁殖性状、脂肪代谢相关的候选基因，为绵羊重要经济性状的分子调控机制研究提供了基础和参考。