凝结芽孢杆菌对畜禽肠道有害菌及有益菌的抑菌性能研究

王雪艳，肖明霞，王乙茹，柳成东，赵 平，王春羲，屈 娥*，程志斌*

（1.云南农业大学，昆明 650201；2.达州职业技术学院，四川 达州 635001；3.昆明三正生物科技（集团）有限公司，昆明 650217）

自2020年7月1日我国饲料与养殖业全面禁止促生长药物饲料添加剂的使用以来，饲用益生菌等功能性“替抗”饲料添加剂的评估与应用技术受到行业高度关注[1-2]。凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）兼具乳酸类益生菌的抑菌作用和芽孢杆菌属益生菌的良好耐热性，因此近年来成为行业替代饲用抗生素应用与研究的焦点[3-5]。目前，大部分文献表明凝结芽孢杆菌能够显著改善畜禽生长性能[6-13]，但也有少数报道显示饲粮添加凝结芽孢杆菌对畜禽生长性能没有明显的改善作用[14-18]。以上饲养试验报道的矛盾提示，评估凝结芽孢杆菌对畜禽生产性能的饲养试验易受试验动物、养殖条件、试验设计等诸多因素的干扰[5,19]，且饲养试验周期长、研究经费高。因此，建立体外科学、高效的实验室评估方法与技术有助于益生菌产品的初步筛选。

抑菌性能是饲用益生菌平衡畜禽肠道菌群、促进生产性能的重要机制之一[3-5]。因此，针对畜禽肠道主要有害菌及有益菌，采用体外抑菌试验技术评估凝结芽孢杆菌的抑菌性能，能够验证饲用凝结芽孢杆菌在畜禽体内发挥平衡肠道菌群、促进生长的确切作用效果。常用的体外抑菌试验法包括：牛津杯法[20-21]、最小抑菌浓度法[22]、杀菌能力法[23]、平板划线法[24]等。其中，牛津杯法常用于各类抗生素及益生菌的抑菌性能评估[20-21,25]。据此，本研究以广谱饲用抗生素土霉素为参照，开展一株凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌及有益菌的抑菌作用评估，以期验证以往饲用凝结芽孢杆菌对畜禽生产性能的作用效果。

1 材料

凝结芽孢杆菌（菌株编号为YNAU 5517），从云南省西双版纳州景洪市农村散养茶花鸡的肠道获得[26]；土霉素，购买于昆明三正生物科技（集团）有限公司；抑菌试验的7个指示菌，包括大肠杆菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大肠杆菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringensCVCC2027）、罗伊氏乳酸杆菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）、嗜热双歧杆菌（Bifidobacterium thermophilusATCC25525），购自北纳创联生物科技有限公司。

2 方法

2.1 试验设计

本研究设计3个处理组，分别为阴性对照（无菌蒸馏水）组、阳性对照组（土霉素）、凝结芽孢杆菌组。采用牛津杯法对比评估凝结芽孢杆菌对以上2类（肠道有害菌、肠道有益菌）7个指示菌的抑制效果。土霉素的浓度依据《饲料药物添加剂使用规范》中全价配合饲料允许添加量范围的上限配制成400 mg·L-1溶液。

2.2 抑菌试验

2.2.1 凝结芽孢杆菌及指示菌的培养

（1）凝结芽孢杆菌的培养，参照柳成东等[25]的报道。（2）指示菌大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、猪霍乱沙门氏菌和鸡白痢沙门氏菌的培养，采用LB培养基（酵母粉5.0 g、胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、蒸馏水1 000 mL）。指示菌产气荚膜梭菌的培养采用血营养培养基（牛肉膏10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、蒸馏水1 000 mL、10%的无菌脱脂纤维羊血）。（3）指示菌罗伊氏乳酸杆菌采用MRS培养基（蛋白胨20.0 g、酵母粉10.0 g、葡萄糖5.0 g、NaCl 2.5 g、K2HPO42.0 g、MgSO41.0 g、番 茄 汁50.0 mL、蒸馏水1 000 mL）。指示菌嗜热双歧杆菌采用BBL培养基（蛋白胨15.0 g、酵母膏粉2.0 g、葡萄糖20.0 g、可溶性淀粉0.5 g、氯化钠5.0 g、L-半胱氨酸0.5 g、1.0 mL吐温-80、肝浸粉2.0 g、蒸馏水1 000 mL）。

2.2.2 指示菌涂布平板制备

将指示菌涂布平板的MRS培养，于121℃灭菌30 min后冷却至50℃，倒入培养皿（25.0～30.0 mL）。凝固后待水分干燥即可涂布。

2.2.3 指示菌液稀释涂布

（1）将培养24 h的猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌、产气荚膜梭菌的菌液吸取800 μL，转入装有7.2 mL无菌水的EP管中，进行梯度稀释，选取稀释梯度为10-4作为涂布菌液。每次操作每个指示菌涂3个培养皿（3次平行测定）。

（2）将培养24 h的罗伊氏乳酸杆菌菌液吸取800 μL，转入装有7.2 mL无菌水的EP管中，进行梯度稀释，选取稀释梯度为10-3作为涂布菌液。每次操作每个指示菌涂3个培养皿（3次平行测定）。

（3）将培养24 h的嗜热双歧杆菌菌液作为涂布菌液。每次操作每个指示菌涂3个培养皿（3次平行测定）。

2.2.4 牛津杯法抑菌性能测定

为了统计比较3个处理组（无菌蒸馏水组、土霉素组、凝结芽孢杆菌组）对同一指示菌的抑制作用，每个指示菌吸取200 μL涂布一个培养皿，每个培养皿中放置3个牛津杯，分别加入100 μL的无菌蒸馏水、土霉素、凝结芽孢杆菌菌液。然后恒温培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径（DIZ）的最大值与最小值，以二者的平均值确定抑菌圈直径的数据。

2.3 抑菌作用的判定方法

抑菌作用的判定方法参考李静舒等[27]的报道。为了对3个处理组的抑菌圈直径进行方差分析，将没有抑制作用的抑菌圈直径值定义为7.8 mm。并依据本试验所用牛津杯的直径值（7.8 mm）将牛津杯外径约2倍16.0 mm区分为敏感与高敏感，因此抑菌作用判定标准如下：DIZ=7.8 mm，不敏感；7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm，敏感；DIZ＞16.0 mm，高敏感。

2.4 统计方法

以上抑菌试验重复操作3次，3个处理组的DIZ数据采用单因素方差分析和LSD法进行多重比较，用SPSS软件进行统计分析，P＜0.05表示差异显著。

3 结果与分析

3.1 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制作用

测定凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制情况，结果见表1和图1。

表1 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的DIZ mm

由表1和图1可知，该株凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制作用达到高敏感（DIZ＞16.0 mm），对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、鸡白痢沙门氏菌和产气荚膜梭菌等抑制作用均为敏感（7.8 mm＜DIZ≤16.0 mm）。阳性对照组土霉素对以上指示菌的抑制作用均达到高敏感，且抑制效果显著高于凝结芽孢杆菌（P＜0.05）。此外，阴性对照组无菌蒸馏水对以上指示菌的抑制作用均为不敏感（DIZ=7.8 mm）。

图1 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有害菌的抑制情况

3.2 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制作用

测定凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制情况，结果见表2和图2。

由表2和图2可知，凝结芽孢杆菌对罗伊氏乳酸杆菌、嗜热双歧杆菌的抑制作用均为不敏感；阳性对照组土霉素对罗伊氏乳酸杆菌的抑制作用达到高敏感，对嗜热双歧杆菌的抑制作用为不敏感。此外，无菌蒸馏水对罗伊氏乳酸杆菌和嗜热双歧杆菌的抑制作用均为不敏感。

表2 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的DIZ mm

图2 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌的抑制情况

4 讨论

4.1 凝结芽孢杆菌对肠道主要有害菌的抑制作用

鸡白痢沙门氏菌是诱发家禽肠道疾病的主要致病菌之一，感染鸡白痢沙门氏菌致使家禽严重腹泻，显著降低生产性能[28]。本研究首次证明，凝结芽孢杆菌对鸡白痢沙门氏菌的抑制作用良好，达到敏感水平，提示该株凝结芽孢杆菌可用于家禽饲粮添加或肠道保健品预防鸡白痢沙门氏菌感染。

猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌K88及K99、产气荚膜梭菌等是导致猪鸡细菌性腹泻、死亡率高的主要致病菌，对养殖生产危害严重[29-31]。本研究结果表明凝结芽孢杆菌对猪霍乱沙门氏菌的抑制达到高敏感水平，这与严涛等[32]报道一致，提示该株凝结芽孢杆菌可用于猪饲粮添加或肠道感染的治疗药物。诚然，这一推测有待于进一步的动物试验验证。此外，凝结芽孢杆菌对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99和产气荚膜梭菌的抑制作用均为敏感，这一结果与前人报道一致[32-35]。

4.2 凝结芽孢杆菌对畜禽肠道主要有益菌抑制作用

乳酸杆菌和双歧杆菌是畜禽肠道的优势有益菌，对维持肠道菌群平衡、保障畜禽生长性能有着重要作用[36-37]。目前，没有体外试验评估凝结芽孢杆菌对乳酸杆菌、双歧杆菌等肠道有益菌抑制作用的报道。鉴于以往大量文献[38-39]证明饲用广谱抗生素对畜禽肠道有益菌乳酸杆菌和双歧杆菌的负面影响，本研究首次开展了凝结芽孢杆菌对乳酸杆菌、双歧杆菌的体外抑菌作用评估。本试验选用了肠道乳酸杆菌的代表指示菌罗伊氏乳酸杆菌以及双歧杆菌的代表指示菌嗜热双歧杆菌，因为这两株菌在畜禽肠道中占比较高[36-37]。

本研究首次发现，凝结芽孢杆菌对罗伊氏乳酸杆菌、嗜热双歧杆菌无抑制作用（不敏感）。这一结果提示饲粮使用凝结芽孢杆菌替代广谱抗生素，能够避免抗生素对畜禽肠道有益菌的不利影响，这可能是饲用凝结芽孢杆菌进一步优化肠道菌群、保障畜禽生产性能的重要机制之一。M.K.Bami等[40]研究显示，与抑菌药物氧化锌比，饲用凝结芽孢杆菌有效降低肉鸡肠道大肠杆菌数量，显著增加了乳酸杆菌的数量，从而保障了肉鸡正常的生长性能。黄遵锡等[41]报道，与饲用抗生素组比，凝结芽孢杆菌组肉鸡肠道的大肠杆菌数量显著下降，乳酸杆菌数量显著上升，从而保障了断奶仔猪正常的生长性能。以上体外抑菌试验与饲养试验检测肠道菌群变化的结果相符，表明体外牛津杯抑菌试验技术适合科学、高效地选用凝结芽孢杆菌等功能性添加剂产品，以解决替抗类功能性添加剂在动物饲养试验中试验周期长、可重复性差、试验成本高等问题。

5 结论

本研究采用体外牛津杯法评估了一株凝结芽孢杆菌对畜禽主要肠道有害菌及有益菌等7个指示菌的抑制作用，首次发现凝结芽孢杆菌对肠道有害菌鸡白痢沙门氏菌有较好抑制作用，且对肠道有益菌乳酸杆菌、双歧杆菌无抑制作用。本研究体外抑菌试验技术可为广大饲料企业科学、高效地选用凝结芽孢杆菌等饲用益生菌提供借鉴。