多烯磷脂酰胆碱联合阿托伐他汀对非酒精性脂肪性肝病小鼠的干预效果

李芊蔚，刘春英，吕梅，王飞

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种代谢性肝损伤，是指因非酒精或其他明确肝脏损伤因素而引起的肝内脂肪过度聚积，其主要临床病理表现为肝细胞脂肪变性[1]。NAFLD主要包括非酒精性单纯性脂肪肝、NAFLD、肝硬化及肝癌等[2]。在我国，NAFLD发病率仅次于慢性病毒性肝炎，非酒精性脂肪肝病的发病逐年升高且发病人群趋于年轻化，严重威胁人民群众身体健康[3]。对于该病的治疗，临床常用药物包括多烯磷脂酰胆碱以及阿托伐他汀[4-5]，但是对于药物作用机制尚未明确[6]。有研究表明，核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎症小体的激活能够促进NAFLD的发生以及发展[7]。本研究采用小鼠NAFLD模型，对比分析多烯磷脂酰胆碱以及阿托伐他汀联用对NAFLD小鼠NLRP3表达情况以及治疗效果的影响，从而探讨药物作用机制，为NAFLD的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验试剂与仪器

多烯磷脂酰胆碱(polyene phosphatidylcholine, PPC)胶囊(36287)购买于赛诺菲(北京)制药有限公司；阿伐他汀(combined with avastatin, ATO)片(85837018)购买于辉瑞公司，C57BL/6雄性小鼠(SCXK(京)2019-0008, 体质量25g)购自购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；肝功能检测试剂盒购自上海透景生命科技有限公司；IL-18以及IL-1β酶联免疫试剂盒、Masson染色试剂盒、苏木素伊红(H&E)试剂盒购自北京索莱宝科技公司；β-actin兔抗鼠单抗(货号：zs9324，批号：90658421)，NLRP3兔抗鼠单抗(货号：ab109085，批号：85642156)、ASC大鼠抗小鼠单抗(货号：ab39774，批号：65213258)和 caspase-1兔抗鼠单抗(货号：ab76315，批号：32658942)购自美国Abcam公司，TRIzol试剂盒购自invitrogen公司；NLRP3免疫组化试剂盒、RIPA 裂解液购于美国Abcam公司；高速离心机购自德国Eppendorf公司；冷冻冷藏两用冰箱购自德国Siemens公司；ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 动物造模及给药

随机选取10只C57BL/6雄性小鼠饲喂普通饲料(Normal组)，40只饲喂甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料连续喂养6周用于构建 NAFLD 模型[8]，Normal组小鼠体质量增加，活动正常且皮毛整洁，NAFLD模型组小鼠活动减少且精神萎靡，体质量减轻伴有脱毛现象，对于NAFLD模型小鼠以及正常组小鼠肝脏行肝组织病理学诊断有明显脂肪肝改变视为造模成功(图1)，本研究设置5组，每组10只小鼠，分组情况如下：Normal组(生理盐水)，Model组(NAFLD+生理盐水)，PPC组(NAFLD+PPC)，ATO组(NAFLD+ATO)，Combine组(NAFLD+PPC+ATO)。造模成功后，采用灌胃给药(给药剂量为PPC：0. 1 mL/kg，ATO：4 mg/kg)，Normal组和Model组灌胃等量生理盐水，每天1次，连续7周。

图1 NAFLD模型大鼠肝脏病理(HE×200)

1.3 肝功能指标检测

各组小鼠首先经心尖取血，在4 ℃条件下，将获得的各组小鼠的血液标本离心15 min，转速5 000 r/min。取清置于-80 ℃冰箱保存以备后续实验检测使用。采用相应肝功检测试剂盒按照操作说明书对于谷丙转氨酶(alanine aminotransfease，ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)、血清胆固醇(serum total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)以及高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)进行检测。同时采用ELISA法检测炎性因子IL-8以及IL-1β的表达水平。

1.4 H&E染色和Masson染色检测肝脏组织病理变化

将心尖取血后的小鼠开腹，取出肝脏组织置于4%的多聚甲醛溶液中固定24 h后，梯度乙醇进行脱水、包埋以及切片处理，按标准步骤对各组小鼠肝脏组织切片进行H&E以及Masson染色，使用IPP 6.0图像分析软件测定Masson染色胶原含量分布变化。

1.5 肝脏组织免疫组化染色

采用免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏组织中NLRP3的表达：首先，将标本按常规方法制成石蜡切片，厚度为4 μm，常规脱蜡，使用3%的H2O2孵育15 min后PBS洗涤3次，抗原微波修复后加入蛋白酶K孵育20 min，PBS洗涤三次后加入NLRP3抗体，4度湿盒孵育过夜；第二天加入POD转化剂，37 ℃湿盒孵育30 min，PBS洗涤，加入DAB显色并采用苏木素染色，PBS冲洗，脱水并封片，待染色完成后，于显微镜下观测并拍照记录，以棕褐色或者棕黄色反应产物为阳性，对于染色结果采用Image J软件进行分析。

1.6 Western blot检测

收集各组小鼠肝脏组织样本加入RIPA裂解15 min，离心3 min，收集离心管上清。采用BCA法对提取的蛋白浓度进行测定。将蛋白样品和上样缓冲液混合均匀，置于100 ℃水浴变性3 min，每个样品上样20 μg蛋白，采用SDS-PAGE电泳，转膜，之后在室温条件下用5%脱脂奶粉封闭 1 h，加入稀释的NLRP3一抗(1∶500)、ASC一抗(1∶1 000)、Caspase-1一抗(1∶500)以及β-actin一抗(1∶1 500)，4 ℃摇床过夜孵育，次日采用TBST缓冲液洗PVDF膜3次，每次30 min，加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h后ECL显影拍照，并采用Image J 软件分析条带的灰度，各目的条带与相应的β-actin条带之间的灰度比值作为蛋白的相对表达量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠肝脏相关功能指标

与Normal组比较，Model组小鼠ALT、AST、TC、TG以及LDL均有有显著升高(P<0.05)，HDL含量明显降低(P<0.05)，证明NAFLD小鼠模型成功构建； Combine组小鼠ALT、AST、TC、TG以及LDL相比于Modle组显著降低(P<0.05)，HDL含量明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肝功能指标

2.2 炎性细胞因子的表达

相比于Normal组，Model组小鼠炎性因子IL-1β、IL-18均有显著增多(P<0.05)，Combine组与Model组相比，炎性因子IL-1β、IL-18显著降低(P<0.05)。见图2。

2.3 小鼠肝脏组织H&E染色

Normal组小鼠肝脏细胞大小正常，呈多边形，核圆、居中，胞质丰富，小叶结构清晰；相比于Normal组，Model组小鼠肝脏组织大部分细胞可见不同程度的肝细胞空泡化，小叶内炎性细胞浸润并伴有点状坏死且肝细胞损伤严重；PPC组、ATO组以及Combine组小鼠肝脏组织细胞空泡化明显减轻，且肝脏组织炎性细胞浸润以及点状坏死程度相比于Model组小鼠明显改善。见图3。

图2 各组小鼠炎性细胞因子的表达 A：各组小鼠炎性细胞因子IL-1β的表达；B：各组小鼠炎性细胞因子IL-18的表达。与Model组相比，*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001

2.4 小鼠肝脏组织胶原增生及NLRP3染色

Masson染色结果表明：Normal组小鼠肝脏组织形态结构未见明显胶原蛋白沉积，Model组小鼠肝脏组织呈现明显肝脏损伤，肝脏组织细胞结构异常并出现明显胶原蛋白沉积现象(蓝色区域)(P<0.05)；PPC组、ATO组以及Combine组小鼠肝脏组织损伤降低且胶原沉积相比于Model组显著减少(P<0.05)。NLRP3染色结果显示相比于Normal组，Model组小鼠肝脏组织NLRP3表达显著增加(P<0.05)。与Model组小鼠相比，PPC组、ATO组以及Combine组小鼠NLRP3表达显著降低(P<0.05)。见图4。

图3 各组小鼠肝脏病理变化(HE×400)

图4 各组小鼠肝脏组织胶原增生及NLRP3染色 A：组织染色切片代表性照片(Masson×200)；B：各组小鼠肝脏组织胶原表达定量结果图(免疫组化×200)；C：各组小鼠肝脏组织NLRP3表达定量图。与Model组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.5 小鼠肝脏组织NLRP3、ASC以及 Caspase-1的蛋白表达水平

与Normal组比较，Model组小鼠NLRP3、ASC以及 Caspase-1显著升高(P<0.05)，PPC组、ATO组以及Combine组小鼠NLRP3、ASC以及 Caspase-1显著降低(P<0.05)。见图5。

图5 各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC以及Caspase-1的蛋白表达水平 A：各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC以及 Caspase-1的电泳蛋白条带图片；B：各组小鼠肝脏组织NLRP3、ASC以及 Caspase-1的蛋白表达量化图。与Model组相比：*P<0.05, **P<0.01

3 讨论

NAFLD是指除酒精以及其他明确的损肝因素所导致的肝组织生理改变，主要特征为肝实质细胞脂肪变性以及肝脏过量脂肪聚积[9-10]。NAFLD后期可导致患者肝硬化甚至肝癌，最新的NAFLD防治指南显示，全球范围内NAFLD发病率增长迅速，高达25%左右[11-12]。在我国，随着生活水平的提高，其患病率也明显升高，特别在经济发达城市已有流行趋势。目前，NAFLD的发病机制尚不明确，相关研究[13]推测首先是肝脏脂肪沉积，随后肝细胞脂肪变性，导致肝脏对炎症和各种损伤更加敏感；其次是氧化应激以及脂质的过氧化作用，炎症反应及细胞凋亡，最终导致NAFLD的发生。

多烯磷脂酰胆碱是从大豆中提取的一种磷脂，主要为多聚乙酷卵磷脂，是构成细胞膜和细胞器膜的重要成分，化学结构与内源性卵磷脂相同，但由于其含有丰富的多价不饱和脂肪酸，在功能上更加多样化，其进入体内后主要通过淋巴或血液途径聚集于肝脏，然后进入细胞或者细胞器内，以完整分子整合于肝细胞膜以及细胞器膜，增加膜的完整性、稳定性以及流动性[14]。多烯磷脂酰胆碱可有效降低氧应激反应以及脂质的过氧化反应、并抑制肝细胞凋亡，同时可通过降低炎症进而减少肝细胞损伤[15]。因此，目前在临床上多烯磷脂酰胆碱被广泛用于治疗NAFLD，并且表现出良好的治疗效果。此外，阿托伐他汀具有降脂作用，对治疗高胆固醇血症等血脂异常相关疾病疗效显著[16]。关于多烯磷脂酰胆碱胶囊联合阿托伐他汀治疗NAFLD的报道较少且对于治疗机制也尚不明确。因此，本研究构建NAFLD小鼠模型，探讨多烯磷脂酰胆碱与阿托伐他汀联用对于非酒精性脂肪肝病的治疗作用以及其相关机制。实验结果表明Model组小鼠ALT、AST、TC、TG以及LDL均有有显著升高(P<0.05)，HDL含量明显降低(P<0.05)，证明了喂养甲硫氨酸胆碱缺乏(MCD)饲料的方法建立小鼠NAFLD模型的可行性。相比于Model组，Combine组小鼠肝脏功能均有显著改善，肝脏细胞损伤程度明显降低。

NLRP是能够识别细胞内的病原体以及细胞自身产生的危险信号的重要因子。研究发现[17]，NLRP3敲除的小鼠肝细胞脂肪沉积作用消失。口服NLRP3炎症小体抑制剂萝卜硫素可改善高脂喂养所致肥胖小鼠的脂肪肝程度[18]。以上研究均证实NLRP3与NAFLD的发生以及后续发展密切相关，并且抑制NLRP3可改善NAFLD。相关研究[19-20]表明，炎性反应和肝功能损伤有密切联系，本研究结果表明：相比于Control组小鼠，Model组IL-1β和IL-18表达显著升高，也揭示了慢性炎症在NAFLD发生发展中的地位，以及多种炎症细胞因子在NAFLD的发病中起到的重要作用。而NLRP3炎性小体是调控IL-1β和IL-18成熟和分泌重要的分子平台，研究发现，ASC蛋白可通过募集pro-caspase-1，使其水解发生自身活化，形成具有酶活性的异二聚体caspase-1，NLRP3在静息状态下通过与泛素连接酶相关蛋白结合而处于抑制状态，激活后可通过ASC蛋白与caspase-1蛋白连接，进而形成活化的NLRP3/caspase-1信号通路。而NLRP3/caspase-1信号通路在炎症反应初期不仅可诱导pro-IL-1β和pro-IL-18的合成，而且caspase-1还可将其催化为成熟的IL-1β和IL-18。有报道[21-22]称，脂多糖可以激活肝脏NLRP3炎症小体，使得包括IL-1β在内的促炎因子表达分泌增加，加快NAFLD的发展。本研究发现，治疗后各组小鼠NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白及IL-1β、IL-18表达均降低，Combine组下降更明显，说明多烯磷脂酰胆碱与阿托伐他汀联用可能通过抑制NLRP3表达及下游信号通路降低IL-1β和IL-18分泌水平到治疗非酒精性脂肪肝病的作用。

综上所述，多烯磷脂酰胆碱联合阿托伐他汀对于非酒精性脂肪肝病的治疗可能是通过抑制肝脏组织NLRP3/caspase-1信号通路相关蛋白的表达，进而降低非酒精性脂肪肝病的发生以及发展进程。但是具体作用机制以及与其他信号通路之间的关系仍需进一步研究。