铁卟啉材料修饰电极用于吗啡的检测

夏晓娟，李 梅，杨 通，胡 蓉，孟 爽，杨云慧

(云南师范大学 化学化工学院，云南 昆明 650500)

吗啡是罂粟提取物中具有药理活性和毒物活性的主要生物碱[1-2].罂粟种子中含有吗啡、可待因等生物碱，是造成鸦片成瘾的主要因素[3].吗啡具有很强的镇痛作用[4-5]，是最早用于临床的麻醉剂[6].目前，世界卫生组织（WHO）推荐将吗啡用于缓解癌症引起的疼痛[7-8].但是过量食用吗啡会导致急性中毒[9-11]，1 名成年人食用60 mg 吗啡就会导致中毒，食用250 mg 就会致死.为预防在医疗过程中的吗啡中毒和对吸毒可疑人员进行排查，建立快速、简单且灵敏地检测人体血液以及尿液中吗啡含量的方法十分必要.迄今为止国内外已经报道了酶联免疫法（ELISA）[12]，毛细管电泳（CE）[13]，免疫荧光层析[14]，气相色谱串联质谱法（GC-MS）[15]等检测吗啡的方法.但是这些检测方法的样品前期准备复杂耗时，需要依赖复杂的仪器和经受充分训练的专业人员，不适用于现场检测[16].电化学传感器是基于待测物本身的电化学性质，将化学量转变成电学量进行检测的装置，具有灵敏度高、成本低、快速及样品处理简单等特点，被广泛应用在基础研究、生物、临床化学、化学分析等领域[17]，是目前最热门的研究领域之一.研究人员用各种材料修饰电极并用于吗啡的检测，这克服了使用裸玻碳电极进行电化学测量时电子转移速率慢以及电极污染等缺点[18].Aliabadi 等[19]将水凝胶作为吸收性聚合物基质与碳糊混合制备电极，该电极成功地应用于1滴尿样中吗啡的测定，检测范围为5.0～200 μmol/L，检测限为1 μmol/L.Atta N F 等[20]利用微波辐射法制备了氧化石墨烯-钯（RGO-Pd）对吗啡进行电化学研究.该电极线性范围为0.34～12 μmol/L，检测限为12.95 nmol/L.Basiri 等[21]用多壁碳纳米管修饰电极表面对吗啡进行检测，该电极在50～920 nmol/L 的浓度范围内检测关系呈线性，检测限为10 nmol/L.

卟啉及其金属卟啉类化合物是芳香族杂环化合物，它们的母体结构为卟吩，拥有吡咯环和次甲基桥联起来的大共轭体系[22]，其衍生物种类众多且具有自身独特的结构.卟啉类化合物因其芳香性强、容易吸附和坚固的结构，并且其金属配位化合物种类繁多，多被应用于医学、仿生学、催化以及化学等领域[23-24].阳卫军等[25]发现铁卟啉材料的催化活性优于钴、锰、铬卟啉等金属卟啉.它可在空气中直接使烷烃氧化，然后快速分解得到过氧化物[26].目前，已有研究报道将卟啉材料修饰电极用于电化学方法进行分析检测.张水锋等[27]将卟啉修饰电极用于水中溶解氧的测定；钱江红等[28]使用钴卟啉修饰电极进行多巴胺等神经递质的测定.目前，尚未见到使用铁卟啉修饰电极进行吗啡的测定的报道.本研究以铁卟啉作为电极的修饰材料，可以增加电极的比表面积，并提供电子快速转移的表面，由此构建的电化学传感器被用于检测人体血清 中吗啡的含量.

1 实验部分

1.1 试剂和仪器5，10，15，20-四苯基卟啉-Fe 购自上海的麦克林生化科技有限公司；盐酸吗啡（中国北京公安部物证鉴定中心）；二次蒸馏水（自制）；硝酸（重庆川东化工集团有限公司）；无水乙醇（天津市风船试剂科技有限公司）；六水合氯化铝（AlCl3·6H2O）、甲醇（CH3OH）、磷酸缓冲溶液（phosphate buffer saline PBS）、壳聚糖（Chitosan）等均购于美国Sigma 公司；三氯甲烷（CHCl3）和盐酸（HCl）购于重庆川东化工有限公司.以上试剂均为分析纯.血清由云南师范大学校医院提供.

玻碳电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司）；CHI660D 型电化学工作站（上海市辰华仪器公司）；真空干燥箱DZF-6020（上海博讯实验有限公司）；甘汞电极（上海鲁硕实业有限公司）；T 超声波清洗器（上海市科道超声仪器有限公司）；透射电镜JEM2100（日本电子株式会社）；铂丝电极（上海鲁硕实业有限公司）；GL-20M 离心机（湖南省长沙市湘 仪离心机有限公司）.

1.2 铁卟啉（PAF-40-Fe）的合成参考文献[29]合成铁卟啉.在100 mL 的三颈圆底烧瓶中分别加入400 mg 的5，10，15，20-四苯基卟啉-Fe 和1.6 g AlCl3，将干燥的40 mL 干燥的CHCl3加入到烧瓶中，用氮气保护60 ℃条件下反应48 h，待冷却至室内温度条件下，离心后接着分别用无水乙醇、3 mol/L 的HCl 溶液和甲醇洗涤3 次，将产物在1 20 ℃真空中干燥，得到的黑色粉末即为铁卟啉.

1.3 卟啉（PAF）的合成参考文献[29]合成PAF.称取间-四苯基卟吩（385 mg，0.62 mmol）和AlCl3（3.00 g，4.5 mmol）一同放入100 mL 的两颈圆底烧瓶中，在氮气保护的情况下向圆底烧瓶中加入40 mL 干燥的三氯甲烷，采用60 ℃油浴反应48 h.反应结束后，搅拌下冷却至室温，离心收集粗产物.将得到的粗产物分别用无水乙醇、3 mol/L的HCl 和甲醇洗涤3 次，之后将产物在120 ℃真空 中干燥，得到黑色粉末，即为PAF.

1.4 铁卟啉修饰电极的制备首先准备好3 mm的玻碳电极（GCE）在3 000 目的砂纸上面打磨干净，然后分别用粒径为1.5 μm、0.5 μm 以及50 nm 的Al2O3抛光粉将电极打磨抛光成镜面.接下来依次在稀硝酸溶液、乙醇以及超纯水中分别超声洗涤3 min，等待自然风干后备用.将铁卟啉加入水中超声至完全分散于水溶液，取铁卟啉分散液与0.5%的壳聚糖混匀，再用移液枪取10 μL 该溶液滴在已经 打磨晾干的电极表面上，晾干后备用.

1.5 吗啡的检测室温下，使用缓冲溶液配制不同浓度吗啡溶液，以铁卟啉/GCE 电极、甘汞电极、铂丝电极等构成三电极体系，首先在-0.1 V 下于含吗啡的PBS 缓冲溶液中（pH 7.0）富集90 s，接着采用差分脉冲伏安法（DPV）检测吗啡在0.2～0.8 V间 的电流响应.实验流程如图1 所示.

图1 铁卟啉修饰电极的制备及检测流程图Fig.1 Flow chart of preparation of Fe porphyrin modified electrode and determination

2 结果与讨论

2.1 材料的表征

2.1.1 铁卟啉的X 射线粉末衍射表征 对合成的产物进行X 射线粉末衍射表征（XRD），其测试扫描速度为1°/min，扫描的范围为5°～ 40°，扫描结果如图2 所示，并没有明显的衍射峰，其XRD 曲线与文献[29]的基本一致，说明这种材料为无定形 结构.

图2 铁卟啉的X 射线粉末衍射表征Fig.2 X-ray powder diffraction characterization of Fe porphyrins

2.1.2 铁卟啉的红外表征 对合成产物的红外进行表征，在红外灯照射下称取1 mg 本文合成的铁卟啉材料和100 mg 纯KBr 混合均匀后研磨，使用红外压片磨具将该混合物压成透明样片，通过FT-IR 吸收光谱仪测定红外光谱.如图3 所示，当偶联反应发生的时候，苯环的C—H 和C—C 在1 650～1 400 cm-1和800～700 cm-1范围内的振动的位置和吸收率移向较低的波数移动并且峰强减小.在产物中我们观察到在750 cm-1附近的另一个峰，这归因于对位取代的苯环.苯环偶联在一起形成延伸的网络结构.此外，金属卟啉的Fe—N 特征振动在1 001 cm-1，表明金属阳离子是卡在卟啉环的中间，证明聚合物合成成功.

图3 铁卟啉的红外光谱图Fig.3 Infrared spectrum characterization of Fe porphyrins

2.1.3 铁卟啉的形貌特征 采用透射电子显微镜（TEM）观察了实验合成的铁卟啉材料的微观形貌（图4）.从透射电镜中可以看出PAF 材料的形貌没有固定的形状，表明材料的无序性，与XRD 测试结果相吻合.

图4 铁卟啉在不同放大倍数下的透射电子显微镜图Fig.4 Transmission electron microscopy of Fe porphyrins at different magnification (left:12 000×;right:60 000×)

2.2 吗啡的电化学行为图5 显示了不同修饰电极在630 μmol/L 吗啡溶液中的DPV 曲线.可观察到吗啡的氧化峰电位均在0.49 V.由图5 可知修饰有铁卟啉的电极电流响应大于卟啉修饰电极以及裸电极的DPV 响应曲线，表明Fe 卟啉对吗啡的检测 具有良好的导电效果.

图5 不同修饰电极在吗啡的PBS 缓冲溶液中的差分脉冲伏安曲线Fig.5 The pulse voltammetry curves of different modified electrodes in morphine PBS buffer solution

2.3 吗啡的循环伏安行为为了考察铁卟啉修饰电极的电化学特性，本实验采用循环伏安法（CV）检测在-0.2～0.8 V 间电极的电流响应，图6 中曲线a、b、c 分别为铁卟啉修饰电极、卟啉修饰电极以及裸玻碳电极在含有630 μmol/L 吗啡的PBS 缓冲溶液（pH 7.0）中的循环伏安响应.从图6 中可看出，吗啡在Fe 卟啉修饰电极（a）、卟啉修饰电极（b）及裸GCE（c）上均出现氧化峰，a 曲线的氧化峰电流大于b、c 曲线的电流，再次说明铁卟啉具有很好的催化性.

图6 不同修饰电极在含有630 μmol/L 吗啡的PBS 缓冲溶液中的循环伏安曲线Fig.6 Cyclic voltammetric curves of different modified electrodes in PBS buffer solution containing 630 μmol/L morphine (a:PAF-40-Fe -modified electrode;b:PAFmodified electrode;c:bare electrode)

实验考察了扫描速度对吗啡氧化峰电流的影响，扫描速度从a 到g 分别为20、40、60、80、100、120、140 mV/s，铁卟啉修饰电极在含有吗啡的PBS 缓冲溶液中的循环伏安曲线如图7 所示.由图7 可以观察到吗啡的氧化峰电流随着扫描速度的增大而增大，并且从内置图可知吗啡的氧化峰电流和扫描速度的平方根成正比，因此电流受扩散控 制.

图7 扫描速度对传感器响应电流的影响（内置图为氧化峰电流对扫描速度平方根的线性关系）Fig.7 Influence of scanning speed on sensor response current(The inset shows the linear relationship between the oxidation current and the square root of scan rate)

2.4 检测条件的优化

2.4.1 铁卟啉质量浓度对吗啡电化学行为的影响 因铁卟啉的质量浓度直接影响该传感器的响应电流的大小，因此在实验中首先考察了不同质量浓度的铁卟啉对传感器响应电流值的影响.图8 为修饰有不同质量浓度的铁卟啉/GCE 在含630 μmol/L吗啡的PBS 缓冲溶液中（pH 7.0）的差分脉冲响应.从图8 中可以看出，铁卟啉质量浓度为1.5 mg/mL时，电流响应最大.因此本实验选用1.5 mg/mL 作为 修饰电极的铁卟啉质量浓度.

图8 铁卟啉质量浓度对铁卟啉修饰电极响应电流的影响Fig.8 Effect of Fe porphyrin concentration on the response current of Fe porphyrin-modified electrode

2.4.2 缓冲溶液对铁卟啉修饰电极响应电流的影响 不同缓冲溶液对传感器的电流响应值也有影响.图9 为铁卟啉修饰电极在pH 为7.0 含630 μmol/L吗啡的PBS 缓冲溶液、丙磺酸盐缓冲溶液（MOPS）、Tris-HCl、乙磺酸盐缓冲溶液（HEPES）中的差分脉冲响应电流.从图9 中可以看到，采用PBS 缓冲溶液时，吗啡的电流响应最大.因此本实验选择PBS缓冲溶液作为缓冲溶液.

图9 缓冲溶液对铁卟啉修饰电极响应电流的影响Fig.9 Effect of buffer solution on response current of Fe porphyrin-modified electrode

2.4.3 缓冲溶液pH 对铁卟啉修饰电极响应电流的影响 为了找出电极的最佳缓冲溶液的pH值，本实验考察了铁卟啉修饰电极在630 μmol/L 吗啡溶液在不同pH 的PBS 缓冲溶液下的电流响应，从图10 中可以看出，缓冲溶液的pH 为7.0 时，电极的电流响应最大.因此，本文选择pH 7.0 为测定吗 啡时PBS 缓冲溶液的酸度条件.

图10 缓冲溶液pH 对铁卟啉修饰电极响应电流的影响Fig.10 The effect of buffer pH on response current of Fe porphyrin -modified electrode

2.4.4 富集时间对铁卟啉修饰电极响应电流的影响 实验考察了铁卟啉修饰电极在-0.1 V、不同富集时间下于含630 μmol/L 吗啡的PBS 缓冲溶液中的电流响应（pH 7.0），从图11 可以看出，电流随富集时间增加而增大，当富集时间为90 s 时，电流响应达到最大并趋于稳定，因此选择90 s 为富集时间.

图11 富集时间对铁卟啉修饰电极响应电流的影响Fig.11 The effect of enrichment time on response current of Fe porphyrin -modified electrode

2.5 铁卟啉修饰电极检测吗啡铁卟啉修饰电极在最佳条件下检测不同浓度的吗啡溶液，用差分脉冲伏安法记录0.2～0.8 V 间传感器的响应电流，结果见图12、13.图12 为吗啡浓度在1.5～1 500 μmol/L时测得DPV 响应曲线，图13 中铁卟啉修饰电极的响应电流与吗啡浓度在1.5～1 500 μmol/L 范围内呈现良好的线性关系，其线性方程为I=0.003 2c+0 .089（R2=0.994 5），检出限为0.5 μmol/L.

图12 铁卟啉修饰电极对不同浓度吗啡的DPV 响应曲线Fig.12 DPV response curves of iron porphyrin modified electrode to morphine of different concentrations

图13 传感器检测吗啡的校正曲线Fig.13 The calibration curve of proposed sensor for the detection of morphine

2.6 铁卟啉修饰电极的选择性在PBS 缓冲溶液（pH 7.0）中分别加入浓度为1 000 μmol/L 的半胱氨酸（Cys）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）、抗坏血酸（AA）、丙氨酸（Ala）、葡萄糖（Glc）、甘氨酸（Gly），和1 000 μmol/L 的吗啡溶液的响应作比较，结果如图14 所示.从图14 中可以看到只有吗啡在0.49 V处有氧化峰，其余均没有出峰，证明了该传感器具有很好的抗干扰能力.

图14 铁卟啉修饰电极的选择性Fig.14 Selectivity of Fe porphyrin-modified electrode

为进一步探究该传感器的选择性，本次实验通过检测将700 μmol/L 吗啡溶液与1 000 μmol/L 半胱氨酸、多巴胺、尿酸、丙氨酸、甘氨酸、葡萄糖、抗坏血酸等溶液按照1∶1 比例均匀地混合后的电流响应，结果如表1 所示.吗啡与干扰物混合后的电流信号的差值和吗啡的电流信号的比值小于5%，表 明了该传感器具有良好的选择性.

表1 吗啡和干扰物混合时的电流响应Tab.1 Current response of morphine mixing with interfering substances

2.7 重现性和稳定性对修饰有铁卟啉的电极在630 μmol/L 的吗啡溶液中连续测定5 次，相对标准偏差（RSD）为5.4%，说明该电极具有很好的重复性.对5 根铁卟啉修饰电极进行测定，相对标准偏差为（RSD）为3.5%，证明铁卟啉修饰电极有良好的重现性，将电极放置了10 d 后，再次在630 μmol/L的吗啡溶液中测定，其电流的响应信号依然是最初的电流信号的82.23%，说明该电极具有较好的稳定 性.

2.8 回收率的测定为了探究该传感器的使用性能，本实验在PBS 溶液稀释的血清中用标准加入法加入不同浓度的吗啡，采用铁卟啉/GCE 修饰电极测定吗啡的回收率，实验结果见表2，吗啡的回收率在88.9%～105.3%之间，表明铁卟啉/GCE 传感 器对吗啡的检测具有良好的实用性.

表2 吗啡样品测定回收率Tab.2 The determination of morphine recovery in samples

3 结论

本文构建了铁卟啉材料修饰的玻碳电极，可用于对吗啡的直接电化学检测，铁卟啉材料作为电极的修饰材料，其导电性能较好.通过实验数据显示该传感器的选择性高、重现性好、检出限低，检测时间为2 min，较为快速.特别是该传感器具有制备简单、使用简单、价格低廉等优点，可以用于真实血清样品中吗啡浓度的快速检测.