无花果沙棘复合果醋发酵工艺优化

胡舰，朱正洁,，梁潇滢，王荣兰，朱云龙*

(1.扬州大学 旅游烹饪学院，江苏 扬州 225127；2.江苏恒顺醋业股份有限公司，江苏 镇江 212100)

无花果(FicuscaricaL.)，蔷薇目、桑科、榕属的多年生木本开花植物，花隐于囊状总花托内，外观见果不见花，故名为无花果[1]。果皮薄且无核，食用方便，质感松软，味浓香甜，氨基酸含量最高可达400 mg/100 g，富含多酚、维生素C、多糖、补骨脂素等活性成分和多种矿物质元素，兼具极高的营养和药用价值[2]。沙棘(HippophaerhamnoidesL.)，归属为胡颓子科、沙棘属落叶性灌木[3]，收录于国家卫健委公布的2019版最新药食同源目录。作为药食两用的原料，沙棘富含多种维生素、微量元素、不饱和脂肪酸以及人体所需的8种必需氨基酸，特别是维生素C的含量极高，是苹果的数百倍，橘子的35倍，而且沙棘果实中的维生素C稳定性极强[4]。此外，沙棘果实中还含有大量的黄酮类化合物、超氧化物歧化酶(SOD)、酚类活性成分等生物活性物质，其药用功效主要有延缓衰老、抵抗辐射、抑制血小板粘附、预防肿瘤、增强免疫力等，对心血管疾病也有良好的抵御效果[5]，是优质的保健食品原料，市场前景广阔。

目前关于无花果和沙棘衍生食用产品的研究已有不少，但尚未见将二者结合生产复配产品的相关报道[6]。

本文以新鲜无花果、沙棘果为原料，在单因素实验的基础上结合响应面实验设计，旨在探究优化无花果沙棘复合果醋的最佳发酵工艺，生产一种新型的健康营养果醋，为无花果、沙棘资源的综合利用提供科学依据的同时，也为调味品市场产品种类的拓展提供了新的方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

无花果干：常熟神农果业有限公司；吕梁野生沙棘果：文水县万家富贡梨专业合作社；高活性酿酒酵母：安琪酵母股份有限公司；活性醋酸菌种：济宁玉园生物科技有限公司；果胶酶(食品级)：苏州久瑞生物科技有限公司；无水乙醇、氢氧化钠、盐酸(以上3种试剂纯度标准为分析纯)：郑州秋雨化工有限公司；蒸馏水：实验室自制去离子水。

1.2 仪器与设备

TM-767多功能食品料理机 中山市帅龙电器有限公司；SPX-70B生化培养箱 上海康路仪器设备有限公司；RHZ-Q全温空气恒温振荡摇床 金坛区水北科普实验仪器厂；TD5A-WS台式离心机 南京晓仪仪器设备有限公司；HH-2恒温数显水浴锅 常州金坛良友仪器有限公司；SNH-CSJ实验室超纯水机 山东聚创环保有限公司；PHSJ-3F台式数显pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA224S赛多利斯电子分析天平 深圳市林涛仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

1.3.2 操作要点1.3.2.1 原料预处理

实验选用新鲜成熟的无花果、沙棘果，此时果实中的含糖量和果酸含量均较高，便于微生物生长发酵。分别将鲜果洗净后置于食品料理机中破碎成无花果汁、沙棘汁备用。

1.3.2.2 果胶酶酶解

分别在无花果汁、沙棘汁中加入质量分数为0.2%的果胶酶，置于水浴锅中50 ℃酶解30 min，原因是应用果胶酶酶解破碎果实，不仅可有效加速果汁过滤，促进澄清，还有利于酒精发酵[7]。

1.3.2.3 离心过滤

将酶解后的无花果汁、沙棘果汁分别置于离心机中，设置条件为转数5000 r/min，时间40 min。目的是去除果汁中的杂质和浮油，再分别用4层纱布过滤，然后按照实验所需比例将二者混合备用。

1.3.2.4 菌种活化

按照1 g蔗糖，20 mL蒸馏水的比例配制糖液，然后加入2 g酿酒酵母在40 ℃培养箱中活化1 h，注意菌种不得出现包心结块的现象。

1.3.2.5 酒精发酵

在无菌条件下，将经活化后的酿酒酵母接种至复合果汁中，添加量为0.2%，搅拌均匀，密封，置于30 ℃的恒温培养箱中培养4～6 d制备无花果沙棘复合沙棘果酒，至酒精度不再上升即可停止发酵，其初始酒精度可用酒精计测量，初始pH值用pH计测量。

1.3.2.6 醋酸发酵

利用无水乙醇NaOH(或者HCl)溶液，按照实验要求对复合果酒的酒精度与pH进行适当的调节，在无菌条件下，取制备好的复合果酒每100 mL于一支250 mL三角瓶中，接入适量醋酸菌种，置于摇床上设置转速为130 r/min，固定温度30 ℃进行醋酸发酵，至酸度不再上升时即可终止发酵。

1.3.2.7 过滤灭菌

将经醋酸发酵的复合果醋用4层纱布过滤，所得原浆醋在水浴锅中进行巴氏灭菌，灭菌条件设置为68 ℃、20 min，经热灌装即可得复合果醋成品。

1.3.3 无花果、沙棘最佳比例的确定

参照酿造食醋的相关国家标准[8]设计感官评价表，主要从外观、滋味和气味、组织状态以及杂质这4个方面对复合果醋产品进行评价。设置无花果、沙棘复配的比例为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1(V/V)。

1.3.4 发酵工艺的确定1.3.4.1 单因素实验

每次实验以1000 g无花果沙棘复合果汁为基础，以复合果醋产品总酸度含量(g/dL)为评价指标，探究醋酸菌接种量、初始沙棘果酒酒精度、初始沙棘果酒pH值和醋酸发酵摇床转数对沙棘果醋发酵的影响。设置4个因素的梯度为：醋酸菌接种量(4%、5%、6%、7%、8%)、初始酒精度(6%、8%、10%、12%、14%)、初始pH值(2.5，3.0，3.5，4.0，4.5)、摇床转数(100，110，120，130，140 r/min)。单因素实验采用控制变量法，固定参数为：醋酸菌接种量5%、初始酒精度8%、初始pH值3.5、摇床转数120 r/min。

1.3.4.2 响应面设计

为确定无花果沙棘复合果醋发酵工艺的最优参数，经单因素实验得出醋酸菌接种量、复合果酒初始酒精度和初始pH值这3个因素对复合果醋发酵工艺较为显著，故以这3个因素为考察变量，以复合果醋产品总酸含量(Y)为考察指标，进行响应面设计，具体设计水平见表1。

表1 复合果醋发酵工艺响应面设计表Table 1 The response surface design of fermentation technology of compound fruit vinegar

1.4 测定方法与数据处理

产品总酸含量的测定采用酸碱中和法[9]。所有实验进行3次平行实验测定记录平均值，统计学分析采用IBM SPSS Statistics 21.0软件，单因素制图采用Origin 7.5，响应面模型拟合采用Design-Expert 8.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 无花果、沙棘最佳比例的确定

按实验要求对不同比例的无花果、沙棘汁在固定的发酵条件下制作而成的复合果醋产品进行感官评价，结果见表2。

表2 无花果、沙棘最佳配比的感官评价表Table 2 The sensory evaluation of the best ratio of fig and sea-buckthorn

由表2可知，不同的无花果、沙棘汁配比所制作的复合果醋感官品质不同，当无花果与沙棘复配比例为1∶3(V/V)时，复合果醋产品的感官品质在外观、滋味和气味、组织状态等方面均为最佳状态，故确定无花果、沙棘的最佳比例为1∶3(V/V)。

2.2 发酵工艺单因素实验

2.2.1 醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响

陈曦等[10]的研究表明，发酵最终产物的总酸含量受发酵时间的影响，而发酵时间又直接受菌株接种量的影响。

由图1可知，在其他3个因素一定的情况下，复合果醋产品的总酸含量在醋酸菌接种量为4%～6%的范围内时，呈逐渐升高的趋势，而当醋酸菌接种量大于6%后趋于稳定。醋酸菌接种量太小时，复合果醋的发酵时间受限，导致发酵不完全，产生的乙酸量低，但是超过一定范围后，菌体细胞的生长繁殖会消耗沙棘果中的营养物质，另外一方面，从实际生产成本的角度考虑，也应要求接种量要尽可能小。所以，选择醋酸菌接种量6%为下一步响应面实验的中心点。

图1 醋酸菌接种量对复合果醋总酸含量的影响Fig.1 Effect of inoculation amount of acetic acid bacteria on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.2 初始酒精度对复合醋总酸含量的影响

由图2可知，在其他3个因素一定的情况下，不同的初始酒精度对复合果醋产品的总酸含量影响较大，初始酒精度在4%～12%的范围内时，复合果醋产品的总酸含量呈现先升高后逐渐下降的趋势。因为在乙醇含量较低时，醋酸菌作用对象有限且生长繁殖较慢，产酸量偏低，随着初始酒精度由4%逐渐升高至8%，沙棘果醋的总酸含量迅速增加；而酒精度一旦超过醋酸菌的可耐受范围，又会直接对醋酸菌的生长代谢产生抑制作用[11]。此外，多余的乙醇还会与乙酸发生酯化反应。因此，选择初始酒精度8%为下一步响应面实验的中心点。

图2 初始酒精度对复合果醋总酸含量的影响Fig.2 Effect of initial alcohol content on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.3 初始pH值对复合醋总酸含量的影响

不同菌种对pH的最适要求和耐受范围均不同，只有选择最适的pH值才有利于菌的生长及产物的生产，以此提高生产效率[12]。

由图3可知，在其他3个因素一定的情况下，当初始pH值在2.5～4.5范围内变化时，复合果醋产品的总酸含量呈现先升高后下降的趋势，当pH值为3.5时，总酸含量达到最高为，6.5 g/dL。所以，综合认为pH为3.5时，最适宜进行复合果醋的醋酸发酵，故而确定响应面实验设计中该因素值3个水平为3.0，3.5，4.0。

图3 初始pH对复合果醋总酸含量的影响Fig.3 Effect of initial pH value on total acid content of compound fruit vinegar

2.2.4 摇床转速对沙棘醋总酸含量的影响

相关研究显示：摇床转速越高，发酵液中溶解的氧气含量越高，二者呈现正相关关系，而醋酸菌属于好氧型微生物，发酵环境中的氧气含量直接影响醋酸菌的生长代谢和发酵效率[13]。

由图4可知，在其他3个因素一定的情况下，复合果醋产品的总酸含量随摇床转速的增加呈先逐渐升高后略有下降最后趋于平稳的趋势，其原因可能是转速太高，使得醋酸发酵过于剧烈，反而不稳定，也难以操控。与图1～图3对比可知，产品总酸含量随摇床转速的变化而变化的幅度最小，可认为其影响不如其他3个因素显著，所以不将其列入下一步的响应面，综合分析，确定复合果醋发酵的最适摇床转速为130 r/min。

图4 摇床转速对复合果醋总酸含量的影响Fig.4 Effect of shaking speed on total acid content of compound fruit vinegar

2.3 发酵工艺的响应面拟合

2.3.1 响应面设计与结果

由2.2部分的实验结果可知，摇床转速对复合果醋总酸含量影响的极差最小，仅为R(摇床转速)=1.9，由此可以说明摇床转速对最终产品总酸含量的影响较其他3个因素稍弱。所以选择醋酸菌接种量(A)、初始酒精度(B)和初始pH值(C)这3个因素为自变量，以复合果醋产品的总酸含量(Y)为优化实验响应值，采用Box-Behnken中心组合实验设计3因素3水平的实验，以此优化复合果醋发酵工艺参数，结果见表3。

表3 Box-Behnken实验设计及结果Table 3 Box-Behnken experiment design and results

续 表

2.3.2 模型建立与方差分析

对Box-Behnken实验设计组配的17组数据进行响应面拟合和统计学分析，可得复合果醋产品总酸含量关于所选3个因素的拟合回归方程：

Y(总酸含量)=7.03-0.3A+0.15B+0.096C-0.17AB-0.03AC+0.028BC-0.73A2-0.65B2-0.39C2。

利用软件对所得的复合果醋总酸含量拟合模型进行方差分析，具体结果见表4。

表4 复合果醋总酸含量方差分析Table 4 The variance analysis of total acid content of compound fruit vinegar

由表4可知，所构建的模型p<0.0001，表明模型极显著，而失拟项p=0.2856，>0.05，说明失拟项不显著(p>0.05)，模型拟合程度良好，该回归方程可用于描述醋酸菌接种量(A)、初始酒精度(B)、初始pH值(C)和复合果醋产品总酸含量的关系。方差分析结果显示R2=0.9830，RAdj2=0.9611，二者接近，说明预测值与真实值相关性很高[14]。比较F值大小可得，3个因素中，对沙棘果醋发酵工艺影响的程度依次为A>B>C，其中一次项A和二次项A2、B2、C2极显著(p<0.01)，显著(p<0.05)的项有一次项B和交互项AB，而不显著(p>0.05)的项是一次项C和交互项AC、BC。需要注意的是，3个因素中虽C项不显著，但是其p值为0.065，十分接近显著水平，这可能与实验次数和精度有关，日后工业生产中需要重新考量。

2.3.3 响应面及等高线分析

Box-Behnken响应面优化法目前已较多地运用于生物培养基优化、药剂制备以及食品加工优化中。3D响应曲面直接显示出了所研究的3个因素对果醋产品发酵工艺的影响趋势，平面等高线图中线与线之间的疏密度则表现了两个不同因素交互对果醋发酵工艺的影响程度，3D曲面图坡度越陡，等高线呈椭圆形且越密集，说明该项对果醋发酵工艺的影响越大[15]。各因素间的交互对果醋发酵工艺的影响见图5。

图5中(a)的响应面坡度最陡峭，等高线呈椭圆形而且较为密集，说明醋酸菌接种量、初始酒精度二者的交互对复合果醋发酵工艺的影响最显著，这与表4中pAB<0.05的结论一致。图5中(b)和图5中(c)的3D响应面图均较为平缓，等高线呈圆形而非椭圆形，说明当初始酒精度一定时，醋酸菌接种量和初始pH值的交互作用对果醋发酵工艺的影响较小；当醋酸菌接种量一定时，初始酒精度和初始pH值的交互作用对果醋发酵工艺的影响也较小，与表4所列回归分析的结果相吻合。

(a)

(b)

(c)

2.3.4 复合果醋发酵工艺的最优参数及验证

利用Design Expert 8.0软件对回归方程偏导求解，可得出果醋发酵的最优工艺参数：醋酸菌接种量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。在此工艺条件下进行3次验证实验，得到果醋产品实际总酸含量为7.270 g/dL，较优化之前的各组数据有显著提升(p<0.05)，此工艺参数下模型的预测值7.339 g/dL，相对误差仅为0.949%，不到1%。由此可以验证本研究所得的理论生产模型与实际情况有较好的拟合度，能有效地反映出醋酸菌接种量、初始酒精度、初始pH值等工艺环节参数与复合果醋产品总酸含量的关系，可用于指导生产发酵型无花果沙棘复合果醋。

3 结论

本研究以新鲜无花果、沙棘果为开发原料，首先，通过感官评价法确定了二者的最佳配比，再利用单因素实验选出了醋酸菌接种量、初始酒精度、初始pH值这3个影响相对显著的因素，在此基础上以果醋总酸含量为响应值进行响应面优化实验，所得模型拟合程度良好(p<0.0001)，得出最终的最优工艺参数为：醋酸菌接种量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1。生产过程中具体操作参数为：醋酸菌接种量5.8%、初始酒精度8.3%、初始pH值3.1、摇床转速为130 r/min。通过验证实验，此工艺下的复合果醋产品总酸含量为7.270 g/dL，较优化之前有显著提升(p<0.05)，产品感官上体现为醋味醇和、酸甜味协调，带有无花果和沙棘特有的果香，开发前景广阔。该研究不仅为优化无花果沙棘复合果醋的发酵工艺提供了科学指导，也对丰富调味品市场产品种类提供了新的方向。